Différenciation de cellules embryoïdes en progéniteurs neuraux à l’aide d’acide rétinoïque

Commencez par des cellules souches embryonnaires cultivées sur une couche de cellules nourricières de fibroblastes, qui maintiennent les cellules souches dans leur état indifférencié.

Ajoutez des enzymes trypsine et de l’EDTA pour perturber l’adhésion de cellule à cellule et détacher les cellules.

Plus tard, ajoutez un milieu de culture enrichi en sérum pour arrêter l’activité enzymatique et transférez la suspension cellulaire dans un tube.

Centrifuger pour collecter les cellules, retirer le surnageant, puis remettre les cellules en suspension dans un milieu contenant de l’acide rétinoïque.

Placez des gouttelettes de cette suspension cellulaire sur la base d’une boîte de culture non adhésive.

Retournez la base pour former des gouttes suspendues et positionnez-la sur le couvercle du plat de culture rempli d’un tampon pour éviter que les gouttelettes ne sèchent.

Dans les gouttes suspendues, la gravité fait que les cellules se déposent au fond, finissant par s’agréger en structures tridimensionnelles appelées corps embryoïdes.

De plus, les cellules absorbent l’acide rétinoïque, qui module diverses voies de signalisation intracellulaires.

Cette modulation stimule la différenciation des cellules souches en cellules progénitrices neurales dotées de la capacité de production de neurones.

Commencez la formation du corps embryoïde en récoltant des cellules souches embryonnaires avec 0,25 % de trypsine-EDTA pendant 2 à 5 minutes à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone. Ajoutez du milieu Dulbecco’s modifié ou IMDM d’Iscove frais avec 15 % de FBS aux cellules qui se détachent, puis transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres.

Centrifuger à 160 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Ensuite, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et préparez une suspension de 5 x 10⁵ cellules par millilitre dans de l’IMDM avec 0,5 micromolaire d’acide rétinoïque. Ensuite, utilisez une pipette à 8 canaux et des pointes de 200 microlitres pour plaquer des gouttes de 120 microlitres par boîte de Pétri de 100 millilitres. Retournez le plat et remplissez le couvercle inversé de PBS pour éviter que les gouttes suspendues ne sèchent. Culture à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant 3 à 4 jours.