Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 4:27 min • July 8th, 2025
Prenez des cultures adhérentes de cellules précurseurs primaires d’oligodendrocytes, ou OPC, dans un milieu de croissance.
Ajoutez des vecteurs lentiviraux de contrôle dans le puits de contrôle et des vecteurs de test, codant pour des protéines de signalisation qui régulent la myélinisation, dans le puits de test, puis incuberez.
Les cellules internalisent les vecteurs, et l’ARN viral est transcrit en ADN et incorporé dans le génome de l’hôte, exprimant les protéines de signalisation dans les cellules testées.
Introduire des enzymes pour détacher les OPC du substrat.
Neutralisez les enzymes et centrifugez pour éliminer les enzymes.
Ajoutez le milieu de croissance et transférez les OPC sur des lamelles à l’intérieur d’une microplaque avec des neurones ganglionnaires de la racine dorsale ou DRG collés. Permettez aux OPC de s’installer.
Remplissez les puits avec le milieu de culture et incuberez. L’interaction avec les neurones DRG déclenche la maturation des OPC en oligodendrocytes.
Les protéines de signalisation exprimées incitent les oligodendrocytes à former des gaines de myéline autour des neurones DRG.
Évaluer la formation de la gaine de myéline induite par les protéines de signalisation dans les cellules d’essai par rapport aux cellules transduites par vecteur de contrôle.
Pour ce protocole, faites cultiver des cellules précurseurs primaires d’oligodendrocytes, les OPC, dans des plaques de 10 centimètres avec 10 millilitres de milieu SATO contenant les facteurs de croissance suivants : CNTF, PDGF, NT3 et Forskoline. Les cellules doivent avoir été cultivées pendant 24 heures sous 8 % de dioxyde de carbone.
Commencez par aspirer le média et retirez-le complètement. Ensuite, remplacez-le par 10 millilitres du même milieu avec les facteurs de croissance. Infectez vos OPC avec du lentivirus, en exprimant la protéine d’intérêt en ajoutant le volume requis de virus goutte à goutte dans le milieu.
De plus, dans une plaque OPC séparée, mélangez le lentivirus témoin qui n’exprime que la GFP dans le milieu. Cultivez les cellules pendant encore 48 heures, puis collectez les OPC des plaques pour les ensemencer sur les neurones DRG cultivés.
Tout d’abord, rincez deux fois chaque assiette avec 8 millilitres d’EBSS. Compléter 1 millilitre de trypsine-EDTA 0,05 % avec 9 millilitres d’EBSS chaud. Ajouter 5 millilitres de trypsine diluée dans chaque assiette. Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux minutes maximum. Neutralisez la trypsine en ajoutant 5 millilitres de FBS à 30 % dans EBSS.
Ensuite, à l’aide d’une pipette de 10 millilitres, lavez les OPC de la surface de la plaque. Tournez la plaque d’un quart de tour à chaque fois pour recueillir toutes les cellules. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Centrifugez les cellules à température ambiante pendant 15 minutes à 180 g.
Maintenant, aspirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu SATO chaud sans facteurs de croissance, et comptez les cellules. Ensuite, préparez les neurones DRG qui sont cultivés sur les lamelles de 22 millimètres en aspirant complètement le milieu de leur plaque.
Ensuite, ensemencez doucement 200 000 OPC, goutte à goutte, dans chaque lamelle. Le volume de semis doit être inférieur à 200 microlitres par lamelle. Laissez les cellules se déposer sans déplacer la plaque. Après 10 minutes, garnir chaque puits d’un millilitre de média SATO chaud. Replaquez maintenant les OPC sœurs restants avec des supports SATO contenant des facteurs de croissance. Ils peuvent être utilisés ultérieurement pour vérifier l’expression de la protéine d’intérêt.