Isolement des neurones ganglionnaires vestibulaires de l’oreille interne d’une souris

Prenez la moitié de la tête d’un bébé souris et retirez le cerveau.

Coupez le haut du crâne et excisez le tissu environnant pour visualiser la capsule otique, une couche externe osseuse protégeant les structures de l’oreille interne.

Transférez le tissu dans une plaque de culture contenant un milieu tamponné.

Séparez les ganglions vestibulaires supérieurs et inférieurs, qui contiennent les corps cellulaires du nerf vestibulaire.

Rasez la crête osseuse et récoltez le ganglion supérieur sous-jacent.

Transférez le ganglion supérieur dans une assiette fraîche contenant le milieu tamponné.

Retirez les tissus adhérents de la surface pour nettoyer le ganglion isolé.

Placez le ganglion dans une solution contenant des enzymes protéolytiques.

Les enzymes dégradent la matrice extracellulaire du tissu, relâchant les cellules.

Transférez le ganglion dans une boîte à fond de verre recouverte de polymère contenant un milieu de culture et dissociez mécaniquement le tissu pour libérer les cellules.

Incuber, permettant aux cellules d’adhérer et d’établir une culture de neurones ganglionnaires vestibulaires.

Retirez le cerveau de la souris euthanasiée à l’aide de ciseaux chirurgicaux fermés. Sectionnez et enlevez le nerf crânien pour détacher complètement le cerveau du crâne. En commençant par l’arrière de la tête, retirez le matériau membraneux transparent à l’aide d’une pince, puis découpez le haut du crâne à l’aide de ciseaux chirurgicaux.

Retirez l’excès de tissu à l’arrière de la tête et du cou, pour rendre la zone de dissection et la capsule otique plus propres et plus faciles d’accès. Transférez le tissu dans une deuxième boîte de Pétri avec une solution fraîche de L-15. Ensuite, localisez la capsule otique et les nerfs auditif, vestibulaire supérieur et vestibulaire inférieur. Séparez les ganglions supérieurs et inférieurs à l’aide de petits ciseaux à ressort et coupez le nerf auditif.

À l’aide d’un scalpel, rasez doucement la crête osseuse pour affaiblir la zone osseuse sous laquelle le nerf plonge dans la capsule osseuse. Retirez soigneusement les débris à l’aide d’un scalpel, en exposant toute la partie enflée du ganglion.

Utilisez les ciseaux à ressort fins pour couper et séparer le ganglion de la branche nerveuse périphérique qui plonge vers l’utricule. Retirez le ganglion supérieur à l’aide d’une pince fine et transférez-le dans une boîte de Pétri de 35 millimètres avec une solution fraîche de L-15.

Après avoir préchauffé la solution enzymatique, versez le mélange d’enzymes dans une boîte de Pétri de 35 millimètres et placez-le dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Nettoyez le ganglion à l’aide de pinces fines et de petits ciseaux à ressort en enlevant l’os, les tissus en excès, les fibres nerveuses et toute autre structure superflue. Prenez soin de minimiser l’ablation de tout tissu ganglionnaire.

Transférez les ganglions nettoyés dans la solution enzymatique préchauffée et remettez-les dans l’incubateur pendant 10 à 40 minutes. Ensuite, transférez les ganglions dans la boîte de Pétri de 35 millimètres avec une solution fraîche de L-15.

Après deux à trois minutes, transférez les ganglions dans une autre boîte de Pétri de 35 millimètres remplie de milieux de culture filtrés. Transférez environ 150 microlitres de milieu de culture filtré sur une parabole à fond en verre revêtu. Ensuite, transférez le nombre souhaité de ganglions sur la lamelle.

Prélevez une petite quantité de milieu de culture dans la boîte de culture et rincez la pipette de trituration avec un milieu pour éviter que le tissu ne colle aux côtés de la pipette en verre. Triturez en passant doucement et à plusieurs reprises le tissu dans la pipette jusqu’à ce que les ganglions soient suffisamment dissociés.

Après cinq minutes, vérifiez au microscope optique si les cellules se sont déposées sur la lamelle. Placez soigneusement une boîte de culture dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 12 à 24 heures.