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Prenez le cortex d’un chiot de souris.
Ajoutez une enzyme protéolytique qui digère la matrice extracellulaire du tissu. Ensuite, dissociez mécaniquement le tissu, en relâchant les cellules.
Ajoutez du milieu glial et de la DNase pour dégrader tout ADN contaminant.
Dissocier mécaniquement le tissu pour libérer les neurones et les cellules gliales.
Une fois que le tissu non digéré s’est déposé, prélevez le milieu contenant les cellules et centrifugez. Retirez le surnageant.
Remettre les cellules en suspension dans un milieu glial et les déposer sur une fiole recouverte de protéines de matrice extracellulaire.
couver. Les astrocytes adhèrent plus fortement à la surface recouverte que les autres cellules. Les milieux gliaux ne favorisent que la survie des cellules gliales.
Remplacez le support pour enlever les débris.
Incuber en secouant pour détacher les cellules précurseurs d’oligodendrocytes sus-jacentes, les OPC et la microglie.
Transférez le milieu avec les cellules sur une plaque de culture.
Incuber en secouant pour faciliter l’adhésion microgliale différentielle.
Transvasez le surnageant OPC non adhérent sur une plaque multipuits recouverte de poly-D-lysine. Incuber pour l’adhésion à l’OPC.
Remplacez le support par un support OPC, ce qui permet la croissance de l’OPC.
Ajouter 1 millilitre de trypsine à 0,05 % avec 0,53 millimolaire d’EDTA dans chaque tube contenant du tissu. Triturez le mélange avec une pipette de 10 millilitres environ 20 fois. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube conique vide de 50 millilitres.
Incuber la solution à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 15 minutes, en agitant doucement les lysats après huit minutes. Après l’incubation, ajoutez 5 millilitres de MGM et 200 microlitres de DNase-I dans chaque tube pour une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre. Triturez chaque lysat 10 fois à l’aide d’une pipette de 10 millilitres.
Ensuite, laissez la suspension cellulaire reposer pendant trois minutes à température ambiante pour permettre aux tissus non dissociés de se déposer au fond du tube. Transférez les suspensions cellulaires dans de nouveaux tubes coniques de 50 millilitres, en laissant derrière eux le tissu non dissocié. Après centrifugation, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 5 millilitres de MGM et la triturer 20 fois.
Plaquez les suspensions cellulaires sur des flacons T-25 enrobés et incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Pour effectuer l’isolement des cellules précurseurs d’oligodendrocytes, agitez les cellules pendant 15 heures. Ensuite, retirez le surnageant de la fiole et placez-le sur une boîte de Pétri stérile.
Incuber le surnageant à 37 degrés Celsius et à 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes, en le remuant après 15 minutes pour éliminer la microglie restante. Retirer le surnageant cellulaire non adhérent. Comptez les cellules et déposez-les sur une surface recouverte de poly-D-lysine à la concentration souhaitée.
Remettez les cellules dans l’incubateur pendant au moins une heure. Ensuite, aspirez doucement 95 % du milieu et ajoutez lentement du milieu OPC chaud, en le pipetant contre la paroi du puits pour minimiser la perturbation des OPC.