Une technique pour générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches embryonnaires humaines
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 4:25 min • July 8th, 2025
Prenez des colonies de cellules souches embryonnaires humaines, ou CSEh, cultivées sur une matrice de soutien.
Aspirez le milieu et ajoutez des enzymes qui dégradent la matrice.
Lavez pour éliminer les enzymes. Ensuite, ajoutez un milieu et une pipette pour déloger les colonies détachées, en les brisant en petites grappes.
Transférez les grappes dans un milieu frais et incubez, ce qui permet aux grappes de former des agrégats sphériques.
Laissez les sphères se déposer et éliminez toutes les cellules mortes.
Incuber avec un milieu contenant le facteur de croissance basique des fibroblastes, ou bFGF, pour la prolifération cellulaire.
Se réapprovisionner avec des milieux contenant des concentrations de bFGF progressivement décroissantes pour faciliter la différenciation cellulaire.
Introduire un milieu d’induction neuronale, favorisant la différenciation des CSEh en cellules souches neurales ou NSC, transformant les sphères en organoïdes présentant une structure en forme de rosette neurale.
Ajoutez des antibiotiques pour empêcher la croissance de microbes contaminants lors d’une culture prolongée.
Les NSC se différencient en neurones et en glies, développant progressivement les organoïdes en une structure complexe ressemblant à un cortex cérébral.
Diluez la solution mère de protéase à une concentration de travail en ajoutant 1 millilitre de solution mère à 5 millilitres de DMEM ou de milieu F12 pour chaque plaque à 6 puits de CSEh. Aspirez et retirez le milieu de culture cellulaire, puis recouvrez les CSEh avec la solution de protéase. Placez les plaques dans l’incubateur pendant 10 à 15 minutes, ou jusqu’à ce que les bords des colonies s’arrondissent et commencent à se séparer de la matrice, mais avant qu’elles ne s’arrondissent complètement.
Inclinez la plaque, aspirez la solution de protéase et lavez doucement les cellules avec 2 millilitres de DMEM ou de F12 pour chaque puits trois fois. Assurez-vous que les colonies restent attachées à la matrice.
Il est donc essentiel que les pièces de SL soient de la bonne taille. Assurez-vous donc qu’ils sont en dispase pendant la durée appropriée. S’ils y restent trop peu de temps, il peut être très difficile de les rincer et de les briser. Et s’ils y restent trop longtemps, ils peuvent en fait se détacher pendant les étapes de lavage.
Rajoutez environ 1 à 1,5 millilitre de milieu mTESR frais dans chaque puits et rincez les cellules de la plaque dans un tube conique de 50 millilitres à l’aide d’un pipetage doux, aspirez et distribuez des CSEh à l’intérieur de la plaque jusqu’à ce qu’elles atteignent environ 1/30 de leur taille d’origine. Aujourd’hui, les amas de colonies ressemblent à des morceaux de 250 à 350 micromètres.
Transférez les cellules dans une seule fiole T75 à très faible attachement, contenant des millilitres de milieu mTESR sans bFGF. Le lendemain, inclinez le ballon de manière à ce que les cellules vivantes s’accumulent dans le coin. S’il y a un grand nombre de cellules qui ont adhéré au fond du flacon, utilisez une pipette de 10 millilitres pour transférer les cellules dans un nouveau flacon.
Attendez-vous à avoir une forte population de cellules mortes pendant les premiers jours. Une fois que les cellules se sont déposées, aspirez les milieux et les cellules mortes, laissant environ 10 millilitres de milieux contenant les cellules vivantes, et ajoutez 20 millilitres de milieux à faible teneur en bFGF, complétés par 30 nanogrammes par millilitre de bFGF. Après deux jours, vérifiez les cellules. La plupart des cellules doivent avoir l’air saines et lumineuses.
Cependant, si plus d’un tiers des cellules apparaissent sombres, inclinez le ballon et remplacez 20 millilitres de milieu par 20 millilitres de milieu à faible bFGF complétés par 20 nanogrammes par millilitre de bFGF. Le jour 3, retirez la moitié du milieu et remplacez-le par 15 millilitres de milieu HSC, complété par 10 nanogrammes par millilitre de bFGF.
Le jour 5, remplacez la moitié du média par 50 millilitres de média d’induction neuronale. Après cela, tous les deux jours, remplacez la moitié du milieu par un média d’induction neuronale. Après trois semaines de culture, ajouter 100 fois la pénicilline-streptomycine au milieu à une concentration finale de 1 fois si désiré. Actualisez la moitié des médias tous les deux jours.
Aperçu
Cet article décrit une méthode permettant de différencier des cellules souches embryonnaires humaines (hESCs) en cellules souches neurales (NSCs), puis ultérieurement en organoïdes ressemblant à des structures du cortex cérébral. Le processus implique la dégradation enzymatique de la matrice de soutien, le regroupement des cellules et l'utilisation de milieux spécifiques pour favoriser la prolifération et la différenciation cellulaires.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie des cellules souches
- Techniques de culture cellulaire
Contexte
- Les cellules souches embryonnaires humaines (hESCs) peuvent se différencier en divers types cellulaires.
- Les cellules souches neurales (NSCs) sont cruciales pour l'étude du développement cérébral et des troubles associés.
- Les organoïdes fournissent un modèle pour comprendre les structures cérébrales complexes.
- La différenciation contrôlée est essentielle pour générer des types cellulaires spécifiques.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour générer des cellules souches neurales (NSC) à partir de cellules souches embryonnaires humaines (hESC).
- Créer des organoïdes qui imitent les structures du cortex cérébral à des fins de recherche.
- Explorer le processus de différenciation et optimiser les conditions de culture.
Méthodes utilisées
- Culture de cellules souches embryonnaires humaines sur une matrice de soutien.
- Traitement enzymatique pour détacher et regrouper les cellules.
- Réduction progressive du facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF) pour induire la différenciation.
- Utilisation de milieux d'induction neurale pour favoriser la formation de cellules souches neurales.
Résultats principaux
- Formation réussie de structures en rosette de type neuronal à partir de cellules souches embryonnaires humaines.
- Différenciation progressive en neurones et en cellules gliales observée dans les organoïdes.
- L'optimisation des conditions du milieu a amélioré la viabilité cellulaire et la différenciation.
- Les organoïdes présentaient des structures complexes rappelant le cortex cérébral.
Conclusions
- La méthode offre une approche robuste pour générer des cellules souches neurales à partir de cellules souches embryonnaires humaines.
- Les organoïdes peuvent servir de modèles précieux pour l'étude du développement cérébral.
- Des recherches supplémentaires peuvent améliorer la compréhension des processus de différenciation neuronale.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode permet une production échelonnée d'organoides cérébraux humains à partir de cellules souches embryonnaires humaines (hESC), offrant un modèle physiologiquement pertinent pour la validation précoce de cibles thérapeutiques en neuropharmacie. En générant des structures de type cortical comprenant des couches neuronales et gliales, elle facilite l'analyse mécanistique et la réduction des risques associés aux candidats médicaments pour le système nerveux central, grâce à un criblage phénotypique pertinent pour l'humain. L'approche renforce la fiabilité prédictive des décisions précliniques en modélisant des processus précoces de neurodéveloppement dans un système reproductible et sans sérum.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation de cibles thérapeutiques dans un système neural tridimensionnel dérivé de l'humain qui imite le fractionnement cortical et la gliogenèse.
- Valeur opérationnelle : Réduit la dépendance aux modèles animaux en offrant une plateforme pertinente pour l'humain afin d'étudier la modulation des voies et l'engagement des cibles.
- Valeur prédictive : Facilite le criblage phénotypique aligné sur les biomarqueurs grâce à la formation quantifiable de rosettes neurales et à la différenciation gliale.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des agrégats d'organoïdes normalisés, dérivés de culture en suspension, adaptés à l'imagerie à contenu élevé et à des lectures multiplexées.
- Valeur opérationnelle : Permet la formation reproductible de sphéroïdes de 250 à 350 μm grâce à une dissociation enzymatique contrôlée, favorisant la standardisation des tests entre différents laboratoires.
- Évolutivité : Utilise des flacons à faible adhérence et des protocoles de renouvellement du milieu compatibles avec la manipulation automatisée des liquides et les formats de culture parallèles.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Modélise la corticogenèse humaine précoce, permettant l'étude des mécanismes des troubles du développement neurologique et des phénotypes de récupération ciblés.
- Déminimisation des risques mécanistiques : Permet le suivi longitudinal de la différenciation des cellules souches neurales (NSC) en neurones et en cellules gliales, soutenant la validation du mécanisme d'action des composés neuroactifs.
- Progression ajustée au risque : Fournit un système pertinent pour l'humain afin d'évaluer les effets de la modulation de cibles sur la structure corticale avant les tests in vivo.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La technique s'inscrit dans la continuité découverte-préclinique, permettant la validation de cibles dans des systèmes neuronaux humains avant l'optimisation du composé candidat et soutenant la production d'organoïdes prêts à être utilisés dans des campagnes de criblage en aval.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses dans les lignées neuronales humaines grâce à une différenciation contrôlée et une maturation structurale d'organoïdes.
- Criblage : Produit des organoïdes uniformes, cultivés en suspension, compatibles avec l'imagerie en temps réel, l'immunofluorescence et les tests électrophysiologiques.
- Analyse : Permet une évaluation quantitative de la formation de rosettes neuronales, de l'élaboration de neurites et de l'expression de marqueurs gliaux comme paramètres fonctionnels.
- Recherche translationnelle : Modélise le développement cortical précoce, permettant de corréler la modulation de cibles avec des phénotypes cellulaires et structuraux pertinents pour les maladies.
- Réutilisation en milieu industriel : Des changements définis de milieux et des protocoles de dissociation établissent une plateforme transférable à plusieurs lignées de cellules souches embryonnaires humaines et à différents fonds génétiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance dans la validation des cibles grâce à des modèles de tissu neural structuré dérivés de cellules humaines.
- Valeur opérationnelle : Des protocoles standardisés de dissociation et d'échange de milieux améliorent la reproductibilité et réduisent la variabilité lors de la génération d'organoïdes.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'aller/arrêt en fournissant une vision précoce des effets des cibles du système nerveux central sur les processus neurodéveloppementaux humains.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation des candidats neurothérapeutiques ajustée au risque, fondée sur leurs effets sur la stratification corticale et la gliogenèse.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules souches, en dissociation enzymatique et en maintien d’organoïdes en 3D.
- Dépend de récipients de culture à faible attachement et d’une formulation précise des milieux pour le titrage du bFGF et l’induction neuronale.
- Exige une technique aseptique et l’utilisation d’antibiotiques afin de prévenir toute contamination durant une différenciation prolongée (> 3 semaines).
- Requiert une optimisation du moment de la dissociation pour obtenir des agrégats de taille comprise entre 250 et 350 μm, sans provoquer une mort cellulaire excessive ou une différenciation spontanée.
- Limité par la variabilité d’un lot à l’autre dans la réponse des lignées de cellules souches humaines, nécessitant des essais préliminaires pour de nouveaux patrimoines génétiques.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 29 août 2026