Purification de cellules précurseurs endothéliales CD31⁺ à l’aide du tri cellulaire activé par magnétisme

Prenez une culture adhérente de cellules progénitrices endothéliales ou EPC, précurseurs des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales.

La culture, obtenue en différenciant des cellules souches pluripotentes, comprend des EPC positifs pour le marqueur de surface CD31 et contaminant des cellules CD31 négatives.

Incuber avec un réactif de dissociation pour détacher les cellules et filtrer pour obtenir une suspension unicellulaire.

Ajoutez un milieu pour neutraliser les enzymes, centrifugez pour éliminer le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un tampon.

Incuber avec un réactif bloquant pour inhiber les récepteurs cellulaires Fc, empêchant ainsi le marquage non spécifique.

Ajoutez un anticorps conjugué au fluorophore spécifique de CD31 et incubez pour marquer les EPC.

Centrifugez et jetez les anticorps non liés. Incuber avec des complexes d’anticorps contenant un anticorps qui se lie aux fluorophores.

Introduisez des nanoparticules magnétiques enrobées de polymère et incuberez, permettant aux nanoparticules de se lier au deuxième anticorps des complexes.

À l’aide d’un champ magnétique, isolez les cellules liées aux nanoparticules.

Jetez la suspension contenant des cellules CD31 négatives non marquées et remettez en suspension les cellules purifiées dans un milieu. Les EPC CD31-positifs sont prêts pour les analyses en aval.

Au 5e jour de la culture des cellules progénitrices endothéliales, aspirez le milieu des puits et ajoutez 1 millilitre de réactif de dissociation dans chaque puits. Incuber l’assiette pendant 6 à 8 minutes à 37 degrés Celsius. À l’aide d’une micropipette, dissociez et singularisez les cellules, puis faites passer la suspension cellulaire à travers une crépine de cellules de 40 micromètres pour filtrer dans un tube de 50 millilitres contenant 10 millilitres de milieu DMEM/F-12.

Pour arrêter la réaction de digestion, ajoutez le milieu DMEM/F-12/10 10 jusqu’à la marque des 50 millilitres. Pipetez soigneusement et réservez 10 microlitres pour compter les cellules. Centrifugez le tube de 50 millilitres à 200 g pendant 5 minutes à 20 à 25 degrés Celsius pour granuler les cellules. Après la centrifugation, retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec 10 millilitres de milieu DMEM/F-12/10.

Transférez la suspension cellulaire dans un tube frais de 15 millilitres. Centrifugez à 200 g pendant cinq minutes à 20 à 25 degrés Celsius pour granuler à nouveau les cellules. Ensuite, mettez la pastille de cellule en suspension dans le tampon d’écoulement 1. Ensuite, ajoutez le réactif bloquant FcR dans un rapport de 1 à 100 et incubez pendant 5 minutes. Ensuite, ajoutez l’isothiocyanate de fluorescéine dilué de rapport 1 à 200 ou l’anticorps CD31 marqué au FITC.

Incuber la suspension pendant 30 minutes dans l’obscurité à une température comprise entre 20 et 25 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, ajoutez 10 millilitres de tampon d’écoulement 1 à l’échantillon et réservez 10 microlitres de suspension pour l’analyse par cytométrie en flux afin de déterminer la fraction de cellules CD31 positives. Centrifugez les cellules à 200 g pendant 5 minutes à 20 à 25 degrés Celsius. Après la centrifugation, remettre les cellules en suspension avec la solution de tampon d’écoulement 1.

Ensuite, ajoutez 5 microlitres du cocktail de sélection FITC pour 100 microlitres de suspension cellulaire. Mélangez soigneusement la solution par pipetage et incubez dans l’obscurité pendant 15 minutes à une température comprise entre 20 et 25 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 5 microlitres de nanoparticules magnétiques pour 100 microlitres de suspension cellulaire. Pipetez bien le mélange et incubez dans l’obscurité pendant 10 minutes à 20 à 25 degrés Celsius.

Transférez la suspension cellulaire dans un tube de cytométrie en flux de 5 millilitres et ajoutez le tampon de flux 1 pour obtenir un volume total de 2,5 millilitres. Ensuite, placez le tube de cytométrie en flux dans l’aimant pendant cinq minutes. Dans un mouvement continu, inversez l’aimant et décantez la suspension cellulaire contenant des cellules non marquées par des anticorps FITC-CD31. Maintenez l’aimant et le tube en position inversée pendant 2 à 3 secondes, puis retirez le liquide restant.

Aspirez toutes les gouttelettes sur le bord du tube avant de remettre le tube en position verticale. Récupérez le tube de cytométrie en flux de l’aimant et ajoutez 2,5 millilitres de tampon de flux 1 pour laver les cellules CD31 positives restantes. Pipetez doucement les cellules de haut en bas, deux ou trois fois pour les remettre en suspension. Ensuite, placez le tube d’écoulement dans l’aimant pendant cinq minutes.

Répétez le lavage au moins quatre fois pour retirer les cellules non marquées FITC-CD31 du tube. Retirez le tube d’écoulement de l’aimant et remettez en suspension les cellules CD31 positives purifiées avec la quantité souhaitée d’un fluide approprié. Réservez deux aliquotes de 1 microlitre de la suspension, l’une pour le comptage des cellules et l’autre pour effectuer une analyse par cytométrie en flux afin d’évaluer la pureté des cellules CD31-positives dans les échantillons de tri cellulaire activé post-magnétique.