Différenciation des cellules souches neurales humaines en progéniteurs neuraux et astrocytaires

Commençons par les neurosphères non adhérentes, un agrégat tridimensionnel de cellules souches neurales humaines dans un milieu conditionné dérivé d’une culture cellulaire.

Ce milieu contient des nutriments, des facteurs de croissance et des composants de la matrice extracellulaire qui maintiennent la viabilité cellulaire.

Centrifugeuse pour collecter les neurosphères.

Traitez-les avec des enzymes trypsine et DNase, mélangez le contenu, puis incuberez.

La trypsine perturbe l’adhésion de cellule à cellule et facilite le détachement cellulaire, tandis que la DNase dégrade l’ADN libre pour empêcher l’agglutination des cellules.

Pipetez le contenu à plusieurs reprises pour former une suspension unicellulaire. Ensuite, ajoutez un inhibiteur de la trypsine pour neutraliser l’activité enzymatique.

Centrifugez et retirez le surnageant, puis remettez les cellules en suspension dans un milieu de prolifération contenant des facteurs de croissance neurale.

Ensemencez la suspension cellulaire sur une lamelle recouverte de polymère placée dans une plaque multipuits. Incuber pour permettre la fixation des cellules souches au polymère.

De plus, sur la base de l’absorption de facteurs de croissance spécifiques, les cellules souches se différencient en progéniteurs neuraux et astrocytaires, qui sont prêts pour une maturation ultérieure en types de cellules spécialisés.

Après avoir préparé le milieu de culture et plaqué les cellules souches neurales humaines selon le protocole de texte, récupérez de l’incubateur le flacon de cellules à passer et apportez-le dans l’enceinte de biosécurité ou BSC. Inclinez doucement le ballon pour permettre aux cellules de couler au fond du milieu accumulé.

Transférez 10 millilitres de fluide en deux portions de 5 millilitres dans un tube propre de 15 millilitres étiqueté « CM » pour un milieu conditionné. Veillez à ne pas aspirer les cellules installées dans le ballon. Transférez 3 millilitres de milieu du tube CM dans un tube de 15 millilitres étiqueté « solution inhibitrice de trypsine ». Ensuite, mettez le tube CM de côté.

Ensuite, retirez les 5 millilitres de milieu et les cellules restantes dans la fiole T75 et placez-la dans un tube propre de 15 millilitres étiqueté « cellules ». Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique et de volumes de 3,5 millilitres de CM, rincez deux fois le ballon T75, en transférant le rinçage CM dans le tube à cellules. Cela permettra d’éliminer toutes les neurosphères de la fiole T75.

Centrifugez le tube à 100 fois g à température ambiante pendant cinq minutes. Pendant que les cellules tournent, obtenez la solution de glucose DPBS préalablement préparée à partir du bain d’eau à 37 degrés Celsius et ajoutez la quantité appropriée de trypsine et de DNase.

Une fois que le tube des cellules a cessé de tourner, retirez tout le surnageant du milieu conditionné et transférez-le dans le tube CM. Ajoutez la solution de trypsine à la pastille cellulaire dans le tube de 15 millilitres et utilisez une pipette de 5 millilitres pour pipeter de haut en bas environ 5 à 10 fois. Fermez le capuchon du tube et incubez-le dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Dans le tube inhibiteur de trypsine, ajoutez le volume approprié d’inhibiteur de trypsine, en ajoutant le même volume de solution que celui utilisé pour la solution de trypsine. Ensuite, placez la solution d’inhibiteur de trypsine dans le bain-marie à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

Après l’incubation, pipetez les cellules de haut en bas 5 à 10 fois. Ensuite, incubez l’échantillon dans le bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes supplémentaires. Après l’incubation cellulaire, pipetez les cellules de haut en bas jusqu’à ce que les sphères soient complètement dissociées. Ensuite, ajoutez immédiatement la solution d’inhibiteur de trypsine et pipetez la suspension cellulaire de haut en bas 10 fois.

Pour compter le nombre de cellules dans la suspension, pipetez 15 microlitres de prémélange de bleu de trypan sur un petit bateau de pesée et ajoutez 5 microlitres de suspension cellulaire. Pipeter de haut en bas 3 à 5 fois pour mélanger. Ensuite, transférez 10 microlitres de la suspension de cellules bleues de trypan de chaque côté d’un hémocytomètre, recouvert d’une lamelle en verre.

Observez les cellules au microscope optique et comptez le nombre total de cellules dans chacune des quatre grilles d’angle. Ensuite, additionnez ces chiffres. Après avoir calculé le nombre de cellules selon le protocole textuel, ajoutez un volume de suspension cellulaire dans chaque fiole T75 pour obtenir 5 x 10⁶ cellules par fiole.

Si le volume est inférieur à 5 millilitres, ajoutez un fluide conditionné supplémentaire jusqu’à 5 millilitres. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de nouveau milieu DFHGFPS contenant des facteurs de croissance dans la fiole. Assurez-vous que le flacon est étiqueté avec le type de cellules, les dates, le nombre de cellules dans le ballon et le numéro de passage. Si vous le souhaitez, incubez les cellules à ce stade.

Pour plaquer les HNSC adhérents, la veille du passage, nettoyez le BSC comme expliqué dans le protocole textuel, et utilisez des pinces pour placer des lamelles en verre stériles de 12 millimètres dans les puits d’une plaque de 24 puits. Enduisez les puits de lamelles avec 250 microlitres par puits de poly-D-Lysine à 0,01 % ou de PDL dans de l’eau stérile, et incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant une heure. Retirez le PDL des puits, puis enduisez-les de 1 microgramme par centimètre carré de laminine DPBS.

Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Si vous n’en avez pas besoin le lendemain, enroulez du parafilm sur les bords de la plaque pour la sceller et conservez-la à 4 degrés Celsius. Retirez tout excès de solution de laminine des puits par aspiration et utilisez 0,5 millilitre de DPBS pour rincer les puits une fois. Ensuite, ensemencez les cellules dans chaque puits à une densité de 0,6 à 1 x 10⁵ cellules par centimètre carré.