Génération d’organoïdes cérébraux de type cerveau antérieur à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Commencez avec une plaque à puits à faible adhérence contenant des cellules souches pluripotentes ou iPSC d’origine humaine dans un milieu de cellules souches complété par un inhibiteur de la Rho-kinase.

Les inhibiteurs pénètrent dans les cellules, bloquent les enzymes Rho-kinase et maintiennent la viabilité cellulaire. Cela favorise la formation d’agrégats iPSC.

Remplacez le milieu par un milieu de cellules souches pour permettre aux agrégats de se développer. Transférez-les dans un plat de culture à faible attachement avec un milieu d’induction corticale.

Les composants de ce milieu provoquent la différenciation des iPSC en cellules neuroectodermiques, un précurseur neural.

Transférez chaque agrégat neuroectodermique sur un film avec des puits peu profonds.

Remplacer le milieu par une matrice à membrane basale et incuber pour permettre la solidification de la matrice et le piégeage des agrégats.

Transférez ces agrégats incorporés dans une matrice dans une boîte contenant un milieu d’induction corticale et incubez avec agitation.

Au fil du temps, les cellules neuroectodermiques utilisent les facteurs de différenciation et se transforment en cellules neuroépithéliales.

Changez le milieu en un milieu de différenciation organoïde, ce qui permet aux cellules de mûrir en types de cellules plus spécialisés, formant un organoïde cérébral qui ressemble au cortex du cerveau antérieur.

Pour générer des agrégats de cellules souches pluripotentes, lorsque les cultures de cellules souches atteignent 70 % à 90 % de confluence, ajoutez 500 microlitres de réactif de dissociation cellulaire dans un puits de la plaque de culture à six puits pour détacher les cellules.

Les cellules souches pluripotentes induites, qui sont adaptées aux conditions de culture monocouche, sont un bon type de cellule pour générer des agrégats car elles sont moins sujettes à la mort cellulaire induite par le stress pendant la procédure de dissociation et d’agrégation.

Après 5 à 10 minutes à 37 degrés Celsius, tapotez doucement la plaque et utilisez 2 millilitres de DMEM/F-12 pour laver les cellules du fond du puits. Transférez la suspension cellulaire résultante dans un tube conique de 15 millilitres et portez le volume de la solution cellulaire à 10 millilitres avec plus de milieu DMEM/F-12.

Après le comptage, transférez 4,5 fois 10 aux troisièmes cellules par agrégat de cellules souches pluripotentes dans un nouveau tube de 15 millilitres, et collectez les cellules par centrifugation. Remettez la pastille en suspension dans le volume approprié de milieu de cellules souches pluripotentes, complété par un inhibiteur de 50 micromolaires de ROCK pour obtenir une concentration moyenne de 4,5 x 10³ cellules par 150 microlitres.

Ensuite, ajoutez 150 microlitres de cellules dans les puits individuels d’une plaque en U de 96 puits à faible fixation, et placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Pour surveiller l’induction du neuroectoderme antérieur, utilisez un microscope de culture tissulaire pour observer de près les changements morphologiques des agrégats de cellules souches pluripotentes chaque jour sous faible grossissement.

Le jour 1, des agrégats cellulaires avec des bordures claires doivent être observés. Le jour 2, aspirez soigneusement environ les 2/3 du milieu sans perturber les agrégats cellulaires au fond de chaque puits, et remplacez le milieu jeté par 100 microlitres de milieu de cellules souches pluripotentes fraîches.

Entre quatre et six jours plus tard, lorsque les agrégats cellulaires atteignent 350 à 450 micromètres de diamètre et présentent des bords lisses, utilisez une pointe de pipette modifiée de 100 microlitres pour transférer jusqu’à 20 agrégats dans une seule plaque de culture à faible fixation de 6 centimètres contenant 5 millilitres de milieu d’induction corticale.

Remplacer le milieu d’induction corticale par un milieu frais une fois tous les trois jours, en surveillant quotidiennement la morphologie des agrégats sous l’objectif 4x. Après quatre à cinq jours dans le milieu d’induction corticale, les bords des agrégats cellulaires devraient commencer à s’éclaircir à la surface, indiquant une différenciation neuroectodermique, et l’organisation radiale d’un épithélium pseudostratifié devrait émerger.

Pour intégrer les agrégats neuroectodermiques dans un échafaudage matriciel, remplissez un extrait de membrane basale sur de la glace pendant deux à trois heures. Pendant que l’extrait décongèle, utilisez des ciseaux stériles pour couper un film de paraffine plastique en un carré de 4 x 4 centimètres pour 16 organoïdes, et placez chaque morceau de film sur un plateau vide de 100 microlitres de pointe de micropipette.

Appuyez sur le film de paraffine du bout d’un doigt ganté pour faire apparaître de petites fossettes et nettoyez le film avec de l’éthanol à 70 %. Après une irradiation UV dans une enceinte de biosécurité fermée et stérile pendant 30 minutes, utilisez une pointe de pipette modifiée de 100 microlitres avec une ouverture de 1 et 1/2 à 2 millimètres pour transférer chaque agrégat de cellules en une seule fossette dans le film.

Lorsque tous les agrégats ont été transférés, utilisez une pointe de pipette non coupée de 100 microlitres pour aspirer soigneusement le milieu de chaque fossette, et ajoutez 40 microlitres d’extrait de membrane basale non dilué à chaque agrégat cellulaire.

Veillez à ne pas endommager les organoïdes par une manipulation brutale ou une aspiration dans la pointe de la pipette, car cela endommagerait le neuroépithélium en développement.

À l’aide de la pointe de la pipette, positionnez les agrégats au milieu de chaque goutte, et à l’aide d’une pince stérile, transférez soigneusement la feuille de film de paraffine plastique dans une boîte de Pétri de 10 centimètres. Placez le plat dans l’incubateur pendant 15 à 20 minutes.

Pendant que l’extrait se solidifie, ajoutez 5 millilitres de milieu d’induction corticale frais dans un plat de culture de six centimètres à faible attachement. À la fin de l’incubation, retournez la feuille de film de paraffine et utilisez une pince stérile pour presser doucement jusqu’à 16 gouttelettes polymérisées dans chaque plat de 6 centimètres. Ensuite, retournez les agrégats dans l’incubateur de culture cellulaire.

Le lendemain, transférez les boîtes de culture organoïde sur un agitateur de culture cellulaire à bascule incliné à un angle de 5 degrés à 14 tr/min à l’intérieur d’un incubateur de culture cellulaire avec surveillance quotidienne par microscopie optique jusqu’à ce que les agrégats atteignent le stade de différenciation d’intérêt.