Co-culture de cellules de Schwann avec des neurones DRG sur une membrane pré-étirée

Prenez une chambre en silicium fixée à une membrane de silicium étirée à revêtement matriciel.

Ajouter les ganglions de la racine dorsale ou la suspension de cellules DRG et incuber.

La matrice favorise l’attachement et la multiplication des cellules, tandis que la surface étirée guide l’alignement des axones.

Ajoutez des inhibiteurs de croissance qui éliminent les cellules gliales en division active, permettant aux neurones non diviseurs de survivre.

Retirez le fluide. Ajouter un milieu de culture et incuber.

Le neurone détecte une rigidité accrue de la membrane dans la direction étirée et oriente la croissance axonale en conséquence.

Ajoutez des cellules de Schwann cultivées et récoltées à la culture DRG et incuberez.

Les cellules de Schwann se fixent à l’axone régénéré, isolant le neurone.

Cela améliore la survie et la fonctionnalité des neurones, établissant une co-culture.

Avant d’ensemencer les neurones DRG, retirez la solution PLL de la chambre. Rincez la surface PDMS à l’eau stérile et faites-la sécher à l’air. Après avoir remis les cellules en suspension, laissez la suspension reposer pendant 1 à 2 minutes pour permettre aux débris de se déposer au fond du tube. Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de suspension cellulaire dans chaque chambre d’étirement et incubez-la à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO₂.

Pour éliminer les cellules gliales en un jour in vitro, ajoutez 10 microlitres ou 15 microlitres de la solution mère de mélange FdU/U dans chaque puits. Après 7 heures, remplacez ce milieu par un milieu de culture standard frais et placez le dispositif de culture pré-étiré dans un incubateur à 37 degrés Celsius dans 5 % de CO₂. Pendant la période de culture cellulaire, changez le milieu tous les deux jours en remplaçant la moitié du milieu épuisé par un milieu frais.

Dans cette procédure, retirez le milieu de culture des cellules de Schwann et ajoutez 5 millilitres de trypsine-EDTA à 0,05 % dans le ballon. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans 5 % de CO₂ pendant 2 à 3 minutes. Vérifiez les cellules au microscope optique à l’aide d’un objectif 10x pour voir si elles se soulèvent du flacon. Ensuite, ajoutez 5 millilitres de milieu de culture aux cellules du ballon et mélangez.

Ensuite, ajoutez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et centrifugez à 20 degrés Celsius pendant 5 minutes. Ensuite, retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 7 millilitres de milieu de croissance standard DOG. Ensuite, transférez 10 microlitres de suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 0,5 millilitre. Mélangez-le avec 10 microlitres de bleu trypan, puis comptez le nombre de cellules avec un hémocytomètre, à l’aide d’un objectif 10x.

Ajoutez le milieu de croissance pour diluer la suspension cellulaire à 5 000 cellules par millilitre. Ensuite, retirez 0,5 millilitre de milieu de la culture DRG dans la chambre étirée et ajoutez 0,5 millilitre de suspension de cellules Schwann à la culture DRG. Cultivez les cellules pendant une semaine à 37 degrés Celsius dans 5 % de CO₂. Changez le milieu tous les deux jours en remplaçant la moitié du milieu épuisé par un milieu de croissance standard frais.