Génération de cellules endothéliales cérébrales à partir de cellules souches pluripotentes induites

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurosciences

0 vues • 4:35 min • July 8th, 2025

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Prenez une culture de cellules souches pluripotentes induites, ou iPSC, dans un milieu d’entretien contenant des inhibiteurs de la rho-kinase.

Les facteurs de croissance maintiennent les cellules indifférenciées, tandis que les inhibiteurs de la rho-kinase améliorent la survie cellulaire.

Remplacez le milieu par un milieu d’entretien frais, en éliminant les inhibiteurs de la rho-kinase. Incuber, favorisant la formation de colonies.

Remplacer régulièrement par des milieux non conditionnés, qui fournissent un environnement contrôlé, déclenchant la différenciation des iPSC en progéniteurs neuraux, puis en cellules endothéliales cérébrales, suivie d’une prolifération cellulaire.

Remplacer par des milieux cellulaires endothéliales contenant de l’acide rétinoïque et des facteurs de croissance des fibroblastes. Couver.

Les facteurs de croissance des fibroblastes facilitent la prolifération cellulaire, tandis que l’acide rétinoïque favorise la maturation des cellules endothéliales cérébrales.

Ajoutez des enzymes protéolytiques pour détacher les cellules. Récupérez les cellules et centrifugez. Jetez le surnageant.

Remettez les cellules en suspension dans un milieu endothélial et ensemencez-les sur un insert membranaire multipuits recouvert de collagène et de fibronectine.

Le puits contient un milieu endothélial. Incuber pour l’adhésion sélective des cellules endothéliales cérébrales.

Remplacez le milieu par un milieu endothélial non supplémenté pour d’autres expériences.

Remettre en suspension 7,5 x 105 cellules dans 12 millilitres de milieu d’entretien des cellules souches et 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK. Aspirer la matrice d’un ballon T75 et transférer la suspension cellulaire dans le ballon. Agitez le ballon pour répartir les cellules et placez-le dans l’incubateur.

Rafraîchissez le milieu tous les jours pendant les deux prochains jours pour éliminer l’inhibiteur de ROCK et favoriser la croissance des colonies de cellules souches. Le troisième jour, commencez la différenciation en changeant le média en un média inconditionné.

Changez le milieu tous les jours pendant les cinq prochains jours. Six jours après le début de la différenciation, élargir sélectivement la population de cellules endothéliales en passant à une cellule endothéliale ou à un milieu EC avec 20 nanogrammes par millilitre de bFGF et 10 micromolaires d’acide rétinoïque. Incuber les cellules pendant deux jours.

Préparez la solution de collagène IV et de fibronectine selon les instructions du manuscrit et utilisez-la pour enrober les plaques de culture cellulaire. Aspirez le milieu EC des cellules et ajoutez 12 millilitres de réactif de dissociation cellulaire. Incuber le ballon à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que 90 % des cellules se soient détachées.

Pendant le temps d’incubation, retirez la solution d’enrobage des plaques préalablement préparées et laissez-les sécher dans une hotte stérile. Une fois les cellules détachées, utilisez une pipette de 10 millilitres pour créer une suspension unicellulaire.

Transférez les cellules dans un tube de 50 millilitres et diluez-les avec un volume égal de milieu libre sans sérum endothélial humain. Ensuite, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Granulez les cellules à 1 500 g pendant 10 minutes. Ensuite, mettez-les en suspension dans un milieu EC fraîchement préparé avec du bFGF et de l’acide rétinoïque pour une concentration de 2 millions de cellules par millilitre.

Ajoutez 500 microlitres de suspension cellulaire en haut d’un insert à 12 puits et 1,5 millilitre de fluide au fond. Répartissez les cellules uniformément sur l’insert et incubez la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, changez le média en EC sans bFGF ni acide rétinoïque.

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Dernière mise à jour : 15 août 2026