Isolement de cellules souches dérivées du tissu adipeux périortique murin
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 3:52 min • July 8th, 2025
Prenez des tissus adipeux périaortiques de souris transgéniques récoltés contenant des cellules souches dérivées du tissu adipeux exprimant des protéines fluorescentes descendant de cellules de crête neurale, ou NCC.
Ajoutez du milieu de digestion et émincez les mouchoirs.
Transférez le tissu haché avec le milieu de digestion dans un tube. Dissociez mécaniquement les fragments.
couver. La collagénase dans le milieu digère la matrice extracellulaire du tissu, libérant des cellules souches, des adipocytes et des fibroblastes.
Ajoutez un milieu contenant du sérum pour arrêter l’activité de la collagénase. Centrifugez et jetez le surnageant contenant les adipocytes.
Remettez les cellules en suspension dans le média et filtrez pour éliminer les agrégats.
Centrifuger le filtrat et retirer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans le tampon de lyse des érythrocytes pour lyser les érythrocytes.
Ajouter un tampon contenant du sérum pour arrêter la lyse. Centrifugez et jetez le surnageant.
Résuspendez les cellules dans la mémoire tampon.
Effectuez un tri cellulaire activé par fluorescence pour isoler les cellules souches fluorescentes.
Les cellules souches isolées peuvent être utilisées pour d’autres expériences.
Transférez le tissu adipeux récolté dans un nouveau tube de microcentrifugation de 2 millilitres, contenant 1 millilitre de milieu de digestion fraîchement préparé, et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour hacher les tissus. Transférez la bouillie tissulaire dans un tube de 50 millilitres contenant 9 millilitres de milieu de digestion frais, et utilisez une pipette de 1 millilitre pour triturer les tissus 10 fois.
Lorsqu’une solution homogène a été obtenue, incubez le tube pendant 30 à 45 minutes à 37 degrés Celsius et 100 tours par minute, en vérifiant toutes les 5 à 10 minutes pour éviter une surdigestion. Lorsqu’une solution de tissu adipeux homogène jaune clair peut être observée lors d’un léger tourbillonnement du tube, arrêtez la digestion avec 5 millilitres de HDMEM complétés par 10 % de sérum fœtal bovin. Après un mélange minutieux, centrifugez l’échantillon de tissu adipeux.
La fraction des cellules vasculaires stromales sera visible sous la forme d’une pastille brunâtre. Remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de milieu de culture et filtrez la suspension cellulaire à travers une passoire à cellules de 70 micromètres.
Récupérez les cellules par une autre centrifugation, et remettez doucement la pastille en suspension dans 5 millilitres de tampon de lyse érythrocytaire. Transférez la suspension sur un tube de 15 millimètres. Après 10 minutes, arrêtez la réaction avec deux centrifugations dans 10 millilitres de PBS, complétées par 1 % de sérum fœtal bovin
.Après la deuxième centrifugation, remettre la pastille en suspension dans 5 millilitres de milieu de culture sur de la glace et recueillir les cellules avec une centrifugation finale. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans 5 millilitres de tampon FACS pour le comptage.
Pour mettre en place une culture NCADSC après leur isolement par FACS selon les protocoles standards, placez les cellules à une concentration de 5 x 103 cellules parcm2 dans chaque puits, une plaque de culture de 12 puits dans un milieu de culture complet, à 37 degrés Celsius, et 5 % de dioxyde de carbone pendant 20 à 24 heures. Le lendemain, lavez les cellules avec 37 degrés Celsius de PBS et nourrissez la culture avec un milieu de culture frais.
Aperçu
Cet article présente un protocole détaillé pour l'isolement, la culture et l'induction de la différenciation adipogénique de cellules souches adipeuses dérivées de la crête neurale (NCADSC) issues du tissu adipeux périvaireux murin. La méthode utilise des souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les cellules de la crête neurale, permettant une identification précise et un tri des NCADSC pour des applications ultérieures.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie des cellules souches
- Isolation et culture des cellules
- Recherche sur les tissus adipeux
Contexte
- Les cellules souches dérivées du tissu adipeux (ADSC) constituent une ressource précieuse pour la médecine régénérative.
- Les ADSC d'origine crânienne possèdent des propriétés et des origines développementales uniques.
- L'isolement de populations pures de NCADSC nécessite des techniques spécifiques d'étiquetage et de tri.
- Le tissu adipeux périvaire murin sert de source pour ces cellules souches.
Objectif de l'étude
- Démontrer un protocole reproductible permettant d'isoler des NCADSC marqués par fluorescence à partir du tissu adipeux périvaireux de souris.
- Permettre une culture et une expansion efficaces des NCADSC triés.
- Faciliter les applications en aval, notamment l'induction adipogénique et les études fonctionnelles.
Méthodes utilisées
- Prélèvement de tissu adipeux péri-aortique chez des souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les cellules de la crête neurale.
- Hachage mécanique et digestion enzymatique (collagénase) du tissu adipeux afin de libérer les cellules du compartiment stromal vasculaire.
- Filtration et lyse des érythrocytes pour purifier la suspension cellulaire.
- Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour isoler les NCADSCs fluorescentes.
- Culture des NCADSCs triées dans un milieu complet, en conditions standard.
Résultats principaux
- Isolation efficace de NCADSC marquées par fluorescence à partir du tissu adipeux périaortique murin.
- La suppression des adipocytes et des érythrocytes permet d'obtenir une fraction purifiée de cellules stromales vasculaires.
- La cytométrie en flux permet la sélection de cellules souches dérivées de la crête neurale pour la culture.
- Les NCADSC isolées peuvent être amplifiées in vitro pour des utilisations expérimentales ultérieures.
Conclusions
- Ce protocole fournit une méthode fiable pour isoler et cultiver des NCADSC à partir de tissu adipeux de souris.
- Le marquage fluorescent et la FACS assurent une grande pureté des cellules souches dérivées de la crête neurale.
- La technique permet des applications en aval en biologie des cellules souches et en recherche sur le tissu adipeux.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'isolement de cellules souches adipeuses dérivées des cellules de la crête neurale (NCADSCs) à partir du tissu adipeux périvaire murin permet la validation ciblée dans les modèles de maladies métaboliques et vasculaires. Le marquage fluorescent et la purification par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) offrent un système reproductible pour l'analyse mécanistique et la réduction des risques associés aux thérapies par cellules souches. Cette approche renforce la fiabilité prédictive du criblage préclinique en assurant l'homogénéité cellulaire et la traçabilité des lignées cellulaires.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'étudier les contributions des cellules souches dérivées des crêtes neurales à l'homéostasie et à la pathologie du tissu adipeux.
- Valeur opérationnelle : Fournit une population cellulaire purifiée et marquée par fluorescence pour des résultats expérimentaux reproductibles.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans les cibles en isolant une fraction stromale vasculaire définie pour des tests fonctionnels.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère une source cellulaire normalisée et viable pour la différenciation adipo-génique et le criblage de la réponse aux médicaments.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité des tests en éliminant les contaminants fibroblastiques et les adipocytes par tri cellulaire assisté par fluorescence (FACS).
- Extensibilité : Permet l'expansion de lignées clonales de NCADSC pour des tests de composés à haut débit.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre le comportement des cellules souches in vitro et la pertinence de la niche adipeuse péri-aortique in vivo.
- Dérisquage mécanistique : Permet d'évaluer le potentiel adipogénique et les différenciations hors cible dans un modèle avec traçage lignéaire.
- Modèle préclinique : Permet des tests pertinents pour la maladie des régulateurs métaboliques dans un contexte d'interface vasculaire-adipocytaire.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le protocole d'isolement s'intègre dans la phase de découverte précoce à la transition préclinique, en fournissant une entrée cellulaire définie pour la validation fonctionnelle en aval et les efforts d'identification de candidats prometteurs.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses sur le rôle des cellules souches de la crête neurale dans la fibrose adipeuse et l'inflammation.
- Criblage : Fournit une population cellulaire purifiée et adhérente, prête à être exposée à des composés et à produire des phénotypes mesurables.
- Analytique : Permet une évaluation quantitative de l'efficacité de la différenciation et des taux de prolifération après l'isolement.
- Recherche translationnelle : Relie le comportement cellulaire aux interactions vasculaires-adipocytaires dans les modèles d'athérosclérose et d'obésité.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une lignée cellulaire souche banqueable et traçable sur le plan génétique, réutilisable dans plusieurs projets portant sur les maladies métaboliques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en isolant une sous-population de cellules souches définie génétiquement à partir d'un tissu adipeux hétérogène.
- Valeur opérationnelle : Normalise le matériel initial par purification basée sur la trierie cellulaire par flux (FACS), améliorant ainsi la cohérence entre les expériences.
- Valeur stratégique : Accroît la fiabilité des décisions de poursuite ou d'abandon en minimisant la variabilité des entrées en cellules stromales vasculaires.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des composés modulant les cellules souches, fondée sur des réponses spécifiques à chaque lignée.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des tissus murins, la digestion enzymatique et le tri cellulaire activé par fluorescence.
- Dépend de l'accès à la collagénase, à un appareil de tri en flux (FACS) et à une infrastructure stérile pour la culture cellulaire.
- Exige une standardisation du temps de digestion et des tampons de lyse afin d'obtenir un rendement constant de la fraction vasculaire stromale.
- L'adaptation à d'autres dépôts adipeux peut nécessiter une optimisation des paramètres de dissociation.
- Limité par la spécificité de l'expression du transgène ; une fluorescence de fond peut exiger des contrôles de sélection (gating).
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 29 août 2026