JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 3:52 min • July 8th, 2025
Prenez des tissus adipeux périaortiques de souris transgéniques récoltés contenant des cellules souches dérivées du tissu adipeux exprimant des protéines fluorescentes descendant de cellules de crête neurale, ou NCC.
Ajoutez du milieu de digestion et émincez les mouchoirs.
Transférez le tissu haché avec le milieu de digestion dans un tube. Dissociez mécaniquement les fragments.
couver. La collagénase dans le milieu digère la matrice extracellulaire du tissu, libérant des cellules souches, des adipocytes et des fibroblastes.
Ajoutez un milieu contenant du sérum pour arrêter l’activité de la collagénase. Centrifugez et jetez le surnageant contenant les adipocytes.
Remettez les cellules en suspension dans le média et filtrez pour éliminer les agrégats.
Centrifuger le filtrat et retirer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans le tampon de lyse des érythrocytes pour lyser les érythrocytes.
Ajouter un tampon contenant du sérum pour arrêter la lyse. Centrifugez et jetez le surnageant.
Résuspendez les cellules dans la mémoire tampon.
Effectuez un tri cellulaire activé par fluorescence pour isoler les cellules souches fluorescentes.
Les cellules souches isolées peuvent être utilisées pour d’autres expériences.
Transférez le tissu adipeux récolté dans un nouveau tube de microcentrifugation de 2 millilitres, contenant 1 millilitre de milieu de digestion fraîchement préparé, et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour hacher les tissus. Transférez la bouillie tissulaire dans un tube de 50 millilitres contenant 9 millilitres de milieu de digestion frais, et utilisez une pipette de 1 millilitre pour triturer les tissus 10 fois.
Lorsqu’une solution homogène a été obtenue, incubez le tube pendant 30 à 45 minutes à 37 degrés Celsius et 100 tours par minute, en vérifiant toutes les 5 à 10 minutes pour éviter une surdigestion. Lorsqu’une solution de tissu adipeux homogène jaune clair peut être observée lors d’un léger tourbillonnement du tube, arrêtez la digestion avec 5 millilitres de HDMEM complétés par 10 % de sérum fœtal bovin. Après un mélange minutieux, centrifugez l’échantillon de tissu adipeux.
La fraction des cellules vasculaires stromales sera visible sous la forme d’une pastille brunâtre. Remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de milieu de culture et filtrez la suspension cellulaire à travers une passoire à cellules de 70 micromètres.
Récupérez les cellules par une autre centrifugation, et remettez doucement la pastille en suspension dans 5 millilitres de tampon de lyse érythrocytaire. Transférez la suspension sur un tube de 15 millimètres. Après 10 minutes, arrêtez la réaction avec deux centrifugations dans 10 millilitres de PBS, complétées par 1 % de sérum fœtal bovin
.Après la deuxième centrifugation, remettre la pastille en suspension dans 5 millilitres de milieu de culture sur de la glace et recueillir les cellules avec une centrifugation finale. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans 5 millilitres de tampon FACS pour le comptage.
Pour mettre en place une culture NCADSC après leur isolement par FACS selon les protocoles standards, placez les cellules à une concentration de 5 x 103 cellules parcm2 dans chaque puits, une plaque de culture de 12 puits dans un milieu de culture complet, à 37 degrés Celsius, et 5 % de dioxyde de carbone pendant 20 à 24 heures. Le lendemain, lavez les cellules avec 37 degrés Celsius de PBS et nourrissez la culture avec un milieu de culture frais.