Isolement des cellules gliales entériques de la sous-muqueuse et de la lamina propria d’une souris
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 4:52 min • July 8th, 2025
Prenez un segment de l’intestin grêle de souris préalablement dépouillé du muscle longitudinal et du plexus myentérique, des couches contenant des neurones entériques et des cellules gliales.
Découpez le tissu et placez-le dans un tampon contenant de l’EDTA. Incuber avec balancement.
L’EDTA perturbe les jonctions cellule-cellule, détachant la muqueuse épithéliale de la lamina propria et de la sous-muqueuse sous-jacentes, des couches de tissu conjonctif contenant des cellules gliales entériques.
Pipeter à plusieurs reprises pour déloger les cellules épithéliales.
Filtrez à travers une crépine de cellule et jetez le flux.
Transférez le tissu dans un tampon de dissociation non enzymatique et incubez-le à bascule. Le tampon de dissociation relâche la lamina propria et la matrice extracellulaire sous-muqueuse, détachant les cellules.
Pipeter à plusieurs reprises pour dissocier davantage les cellules.
Filtrez à travers une crépine pour collecter les cellules.
Centrifugez et remettez les cellules en suspension dans un tampon.
Prenez des puits enrobés de protéines d’adhésion contenant un milieu de croissance gliale et mettez les cellules en plaques.
Le revêtement facilite l’adhésion cellulaire, tandis que les facteurs de croissance favorisent sélectivement la prolifération des cellules gliales, établissant une lamina propria et une culture de cellules gliales sous-muqueuses.
Pour enlever la muqueuse épithéliale, utilisez d’abord des ciseaux fins pour couper les intestins en morceaux d’environ 0,5 centimètre et recueillir les morceaux dans 30 millilitres de solution glacée EDTA/HEPES/DPBS. Basculez la solution contenant des tissus à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes à environ 60 inclinaisons par minute.
Préhumidifiez une pipette en plastique de 5 millilitres en pipetant le tampon EDTA/HEPES/DPBS de haut en bas une fois, puis utilisez la pipette pré-humidifiée pour triturer le tissu et tamponner la suspension 20 fois pour déloger la muqueuse épithéliale.
Prélevez le tissu en versant le mélange à travers une passoire en nylon de 100 microns et utilisez une pince à bec effilé pour placer le tissu retenu dans la passoire dans un nouveau tube à centrifuger conique de 50 millilitres contenant 30 millilitres d’EDTA/HEPES/DPBS glacé. Répétez l’incubation EDTA/HEPES/DPBS une deuxième fois en berçant le tissu à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes à environ 60 inclinaisons par minute pour enlever la muqueuse épithéliale supplémentaire.
Effectuez une trituration douce à l’aide d’une pipette pré-humidifiée de 5 millilitres. Le tissu aura tendance à coller à l’intérieur de la pipette à mesure qu’une plus grande partie de l’épithélium est retirée.
Une trituration douce est nécessaire à ce stade, car les cellules gliales entériques sont plus fragiles.
Prélevez le tissu après la deuxième incubation en versant le mélange à travers une passoire en nylon de 100 microns et jetez le flux. Le deuxième flux continu doit être sensiblement moins trouble que le premier. Répétez les incubations EDTA de 10 minutes jusqu’à ce que la solution soit presque claire.
Transférez le tissu de la passoire en nylon dans un tube à centrifuger conique de 15 millilitres contenant 5 millilitres de la solution de récupération cellulaire disponible dans le commerce. Ensuite, bercez pendant 25 à 30 minutes à 4 degrés Celsius. Triturez doucement 10 fois pour dissocier les cellules gliales entériques de la lamina propria, puis filtrez à travers un filtre de 40 microns et recueillez le filtrat dans un tube propre de 50 millilitres.
Rincez le mouchoir sur le filtre en nylon avec 1 millilitre de DPBS. Jetez le tissu et transférez les 5 à 6 millilitres de filtrat dans un tube à centrifuger conique propre de 15 millilitres. Faites tourner le filtrat à 2 000 fois g dans une centrifugeuse à godets oscillants pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius.
Remettez en suspension la pastille contenant des cellules gliales dans au moins 1 millilitre de tampon de remise en suspension en pipetant doucement la pastille de haut en bas avec la pointe de pipette de 500 microlitres sans introduire de bulles. Enfin, plaquez les cellules gliales entériques en ajoutant 200 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque à 6 puits recouverte de laminine ou 100 microlitres à chaque puits d’une plaque à 12 puits contenant un milieu de croissance gliale.
Aperçu
Cet article décrit une méthode permettant d'isoler des cellules gliales entériques à partir de segments d'intestin grêle de souris. Le processus implique l'utilisation de l'EDTA pour perturber les jonctions entre les cellules, ainsi qu'une série d'incubations et de filtrations afin d'obtenir une culture pure de cellules gliales.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Recherche sur les cellules gliales
Contexte
- Les cellules gliales entériques jouent un rôle crucial dans le système gastro-intestinal.
- L'isolement de ces cellules est essentiel pour étudier leurs fonctions et leurs interactions.
- Les méthodes traditionnelles peuvent ne pas permettre d'obtenir des cultures pures de cellules gliales.
- Cette méthode vise à améliorer l'efficacité de l'isolement des cellules gliales.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole fiable pour l'isolement des cellules gliales entériques.
- Faciliter les recherches ultérieures sur le rôle des cellules gliales dans le système nerveux entérique.
- Fournir une méthodologie détaillée aux chercheurs du domaine.
Méthodes utilisées
- Disséction de segments d'intestin grêle de souris.
- Incubation dans l'EDTA pour détacher les cellules épithéliales.
- Filtration à travers des filtres en nylon pour cellules afin de recueillir les cellules gliales.
- Centrifugation et resuspension dans un milieu de croissance pour la culture cellulaire.
Résultats principaux
- Isolation réussie de cellules gliales entériques à partir de tissu intestinal.
- Mise en place d'une culture de cellules gliales avec une haute pureté.
- Démonstration de l'efficacité de la méthode de dissociation basée sur l'EDTA.
- Présentation d'un protocole détaillé pour les études futures.
Conclusions
- La méthode fournit une approche fiable pour isoler les cellules gliales entériques.
- Ce protocole peut améliorer la recherche sur les fonctions des cellules gliales entériques.
- De futures études pourront s'appuyer sur cette méthodologie pour diverses applications.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'isolement fiable des cellules gliales entériques à partir de la sous-muqueuse et de la lame propre intestinale de la souris permet le développement de modèles in vitro pertinents pour les maladies en neurosciences gastro-intestinales et la découverte de médicaments. Cette capacité soutient la détection mécanistique des risques et la validation des cibles en recherche sur le système nerveux entérique, facilitant une continuité translationnelle depuis les premières découvertes jusqu'aux études précliniques. Des protocoles standardisés d'isolement cellulaire renforcent la fiabilité prédictive et la reproductibilité au sein des portefeuilles de recherche et développement.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet d'étudier la fonction des cellules gliales entériques dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Contribue à l'atténuation des risques biologiques en fournissant des populations pures de cellules gliales pour des études mécanistiques.
- Facilite la validation fonctionnelle des cibles dans le contexte des troubles gastro-intestinaux.
- Améliore la fiabilité prédictive pour le tri précoce des projets dans un portefeuille.
Développement de tests et criblage
- Fournit des cultures primaires de cellules gliales validées pour le développement de tests en aval.
- Permet la standardisation et la reproductibilité des tests grâce à des étapes d'isolement définies.
- Permet une évaluation quantitative des effets des composés sur les cellules gliales entériques.
- Prépare des systèmes cellulaires évolutifs pour le criblage et l'analyse mécanistique.
Recherche translationnelle et préclinique
- Établit une continuité entre les modèles gliaux in vitro et les études gastro-intestinales in vivo.
- S'inscrit dans les stratégies translationnelles de biomarqueurs ciblant le système nerveux entérique.
- Appuie les décisions d'avancement ajustées au risque en fournissant des données précliniques solides.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques dans les filières de développement de médicaments gastro-intestinaux.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce protocole d'isolement établit les cultures de cellules gliales entériques comme des outils fondamentaux, depuis la découverte initiale jusqu'à la validation préclinique dans les domaines des neurosciences gastro-intestinales et du développement de médicaments.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses et l'élucidation des voies biologiques dans le domaine de la biologie des cellules gliales entériques.
- Essais de criblage : Fournit des tests cellulaires reproductibles et quantitatifs pour l'évaluation de composés.
- Analytique : Produit des résultats mesurables permettant de comparer les conditions expérimentales et les réponses cellulaires.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les résultats in vitro et les modèles gastro-intestinaux in vivo lorsqu'ils sont associés à des stratégies de biomarqueurs.
- Réutilisation en milieu professionnel : Offre un protocole standardisé et réutilisable pour la génération de cultures primaires de cellules gliales dans différents projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la recherche en neurosciences entériques.
- Valeur opérationnelle : Renforce la standardisation, la reproductibilité et l'extensibilité des protocoles d'isolement cellulaire.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision quant au passage à l'étape suivante (go/no-go) et l'efficacité du capital en réduisant les risques biologiques tardifs.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation et l'avancement ajustés au risque des candidats-médicaments gastro-intestinaux.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en dissection tissulaire et en techniques de culture cellulaire primaire.
- Requiert un accès à des tampons spécialisés, à du matériel de culture revêtu et à du matériel de centrifugation.
- Exige une standardisation inter-équipes pour assurer la reproductibilité entre les expériences et les sites.
- Pourrait nécessiter des adaptations selon les souches de souris ou les régions du tube digestif.
- La fragilité cellulaire et le rendement pourraient limiter l'extensibilité pour les applications à haut débit.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Isolation et culture des kératinocytes de la souris primaire de la peau de souris néonatale et adulte
Vidéos connexes
0 Vues
Isolement, caractérisation et différenciation des cellules souches cardiaques du coeur de souris adulte
Vidéos connexes
0 Vues
Isolement des cellules mononucléaires Lamina Propria du colon murine à l'aide de la collagène E
Vidéos connexes
0 Vues
Isolement des macrophages du ganglion de la racine dorsale de la souris par dissociation mécanique
Vidéos connexes
0 Vues
Isolement de la microglie du cortex d’un cerveau de souris adulte
Vidéos connexes
0 Vues
Obtention d’une culture mixte de cellules gliales à partir d’un cerveau de souris néonatale
Vidéos connexes
0 Vues
Une
Vidéos connexes
0 Vues
Isolation des corticale microglie avec immunophénotype préservée et fonctionnalité De murins nouveau-nés
Vidéos connexes
0 Vues
La caractérisation et l’isolement des microglies primaire de souris par Centrifugation en Gradient de densité
Vidéos connexes
0 Vues
Isolement des cellules gliales entériques de la sous-muqueuse et de la Lamina Propria de la souris adulte
Vidéos connexes
0 Vues
Dernière mise à jour : 29 août 2026