Isolement des cellules gliales entériques de la sous-muqueuse et de la lamina propria d’une souris

Prenez un segment de l’intestin grêle de souris préalablement dépouillé du muscle longitudinal et du plexus myentérique, des couches contenant des neurones entériques et des cellules gliales.

Découpez le tissu et placez-le dans un tampon contenant de l’EDTA. Incuber avec balancement.

L’EDTA perturbe les jonctions cellule-cellule, détachant la muqueuse épithéliale de la lamina propria et de la sous-muqueuse sous-jacentes, des couches de tissu conjonctif contenant des cellules gliales entériques.

Pipeter à plusieurs reprises pour déloger les cellules épithéliales.

Filtrez à travers une crépine de cellule et jetez le flux.

Transférez le tissu dans un tampon de dissociation non enzymatique et incubez-le à bascule. Le tampon de dissociation relâche la lamina propria et la matrice extracellulaire sous-muqueuse, détachant les cellules.

Pipeter à plusieurs reprises pour dissocier davantage les cellules.

Filtrez à travers une crépine pour collecter les cellules.

Centrifugez et remettez les cellules en suspension dans un tampon.

Prenez des puits enrobés de protéines d’adhésion contenant un milieu de croissance gliale et mettez les cellules en plaques.

Le revêtement facilite l’adhésion cellulaire, tandis que les facteurs de croissance favorisent sélectivement la prolifération des cellules gliales, établissant une lamina propria et une culture de cellules gliales sous-muqueuses.

Pour enlever la muqueuse épithéliale, utilisez d’abord des ciseaux fins pour couper les intestins en morceaux d’environ 0,5 centimètre et recueillir les morceaux dans 30 millilitres de solution glacée EDTA/HEPES/DPBS. Basculez la solution contenant des tissus à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes à environ 60 inclinaisons par minute.

Préhumidifiez une pipette en plastique de 5 millilitres en pipetant le tampon EDTA/HEPES/DPBS de haut en bas une fois, puis utilisez la pipette pré-humidifiée pour triturer le tissu et tamponner la suspension 20 fois pour déloger la muqueuse épithéliale.

Prélevez le tissu en versant le mélange à travers une passoire en nylon de 100 microns et utilisez une pince à bec effilé pour placer le tissu retenu dans la passoire dans un nouveau tube à centrifuger conique de 50 millilitres contenant 30 millilitres d’EDTA/HEPES/DPBS glacé. Répétez l’incubation EDTA/HEPES/DPBS une deuxième fois en berçant le tissu à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes à environ 60 inclinaisons par minute pour enlever la muqueuse épithéliale supplémentaire.

Effectuez une trituration douce à l’aide d’une pipette pré-humidifiée de 5 millilitres. Le tissu aura tendance à coller à l’intérieur de la pipette à mesure qu’une plus grande partie de l’épithélium est retirée.

Une trituration douce est nécessaire à ce stade, car les cellules gliales entériques sont plus fragiles.

Prélevez le tissu après la deuxième incubation en versant le mélange à travers une passoire en nylon de 100 microns et jetez le flux. Le deuxième flux continu doit être sensiblement moins trouble que le premier. Répétez les incubations EDTA de 10 minutes jusqu’à ce que la solution soit presque claire.

Transférez le tissu de la passoire en nylon dans un tube à centrifuger conique de 15 millilitres contenant 5 millilitres de la solution de récupération cellulaire disponible dans le commerce. Ensuite, bercez pendant 25 à 30 minutes à 4 degrés Celsius. Triturez doucement 10 fois pour dissocier les cellules gliales entériques de la lamina propria, puis filtrez à travers un filtre de 40 microns et recueillez le filtrat dans un tube propre de 50 millilitres.

Rincez le mouchoir sur le filtre en nylon avec 1 millilitre de DPBS. Jetez le tissu et transférez les 5 à 6 millilitres de filtrat dans un tube à centrifuger conique propre de 15 millilitres. Faites tourner le filtrat à 2 000 fois g dans une centrifugeuse à godets oscillants pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius.

Remettez en suspension la pastille contenant des cellules gliales dans au moins 1 millilitre de tampon de remise en suspension en pipetant doucement la pastille de haut en bas avec la pointe de pipette de 500 microlitres sans introduire de bulles. Enfin, plaquez les cellules gliales entériques en ajoutant 200 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque à 6 puits recouverte de laminine ou 100 microlitres à chaque puits d’une plaque à 12 puits contenant un milieu de croissance gliale.