Technique de prélèvement et de dissociation des ganglions de la racine dorsale pour les cultures neuronales

Prenez une section de la colonne vertébrale d’un rat et divisez-la pour enlever la moelle épinière.

Détachez les ganglions de la racine dorsale, ou DRG, un groupe de neurones entourés de cellules gliales satellites, ou SGC.

Placez les DRG dans un milieu de croissance. Retirez les racines nerveuses pour réduire la contamination par le SGC.

Traiter avec de la collagénase pour dégrader la matrice tissulaire et laver pour éliminer les enzymes.

Introduire de la trypsine pour perturber les connexions intercellulaires. Ajoutez un sérum contenant des protéines qui désactivent la trypsine.

Ajouter le milieu de croissance et dissocier mécaniquement le tissu. Filtrez la suspension pour isoler les cellules individuelles et centrifugez-la pour éliminer les débris tissulaires.

Remettre les cellules en suspension pour les superposer sur un milieu à gradient de densité et centrifuger.

Les neurones à plus forte densité s’installent au fond, facilitant la séparation des SGC.

Remettez les neurones en suspension dans un milieu de culture. Transférez-les sur un puits recouvert d’un substrat de culture, permettant la fixation des cellules.

Compléter avec des facteurs de croissance nerveuse pour la survie neuronale.

Pour obtenir les neurones DRG après avoir prélevé la moelle épinière, commencez par retirer toutes les parties dorsales, puis utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles et tranchants pour diviser la colonne vertébrale en deux le long de l’axe longitudinal, exposant le tissu du cordon. Coupez la colonne vertébrale en deux segments plus petits sous le niveau de la cage thoracique, puis utilisez des pinces fines pour retirer délicatement tout le tissu du cordon, en prenant soin de ne pas tirer et retirer les racines DRG, qui apparaissent comme des filaments blancs sortant directement des canaux.

Une fois que tout le tissu central a été retiré, utilisez des pinces très fines pour tirer toute la racine DRG, en atteignant profondément dans les canaux vertébraux et en prenant soin de ne pas endommager les racines des ganglions. Placez le DRG dans une boîte de Pétri de 60 millimètres carrés contenant 3 à 4 millilitres de milieu F-12 de Ham, complété par des antibiotiques. Ensuite, sous un microscope à dissection, utilisez une pince stérile et un scalpel pour éliminer tout excès de racines nerveuses entourant les ganglions afin de réduire la contamination des cellules satellites.

Ensuite, transférez le DRG dans une boîte de Pétri de 35 millimètres carrés contenant 1,8 millilitres de milieu F-12 frais, et ajoutez 200 microlitres de solution mère de collagénase de type 4. Incuber le DRG pendant une heure, puis aspirer soigneusement le milieu à l’aide d’une pipette en verre, en prenant soin de ne pas aspirer ou endommager le DRG.

Répétez l’étape de collagénase et lavez le DRG avec un support F-12. Après le deuxième lavage, ajoutez 1,8 millilitre de milieu F12 et 200 microlitres de trypsine aux cellules, en retirant la trypsine et en ajoutant 1 millilitre de milieu complété par 500 microlitres de FBS pour arrêter la réaction enzymatique. Ensuite, aspirez le milieu et lavez doucement le DRG avec du milieu F-12 trois fois pour éliminer toute trace de sérum.

Maintenant, nourrissez les cellules avec 2 millilitres de milieu F-12 frais et utilisez une pipette en verre pour transférer soigneusement la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Pipette de haut en bas 8 à 10 fois pour dissocier doucement les neurones, puis laissez la pastille s’accumuler au fond du tube. Lorsque le granulé est débourbé, transférez le surnageant dans un nouveau tube et ajoutez 2 millilitres de milieu F12 frais au granulé, en répétant la dissociation mécanique et le transfert de milieu jusqu’à ce que la suspension devienne homogène.

Ensuite, triturez la suspension cellulaire trois à quatre fois, suivie d’une filtration de la suspension homogénéisée résultante à travers une crépine cellulaire de 100 microns dans un nouveau tube de 50 millilitres. Centrifugez les cellules dans un tube de 15 millilitres. Pendant qu’ils tournent, pipetez lentement de l’albumine sérique bovine à 15 % fraîchement préparée à l’intérieur d’un tube de 15 millilitres maintenu à un angle de 45 degrés pour créer une traînée protéique progressive en utilisant les chiffres sur le tube comme référence pour la piste de formage.

Ensuite, aspirez le surnageant des cellules, en économisant les 500 derniers microlitres pour remettre la pastille en suspension, et distribuez lentement les cellules le long de la piste protéique dans le nouveau tube. Après avoir fait tourner à nouveau les cellules, remettez la pastille en suspension dans 1 millilitre de milieu BS modifié et ensemencez les cellules dans un petit volume de milieu dans une plaque à 24 puits pendant deux heures. Lorsque les cellules se sont fixées, ajoutez du milieu BS frais complété par 50 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance nerveuse.