Isolement et culture de péricytes cérébraux de souris

Ajoutez un tampon au tissu cérébral de la souris et homogénéisez-le pour libérer des cellules et des microvaisseaux.

Ensuite, ajoutez la solution BSA-dextran à l’homogénat. Mélanger et centrifuger pour séparer les composants. Jetez le surnageant.

Remettez les microvaisseaux en suspension dans le tampon et passez-les à travers un filtre, en retirant les plus gros vaisseaux.

Maintenant, centrifugez le filtrat et retirez le surnageant. Remettez les microvaisseaux en suspension dans un tampon contenant des ADN.

Ajoutez des enzymes protéolytiques pour libérer les cellules endothéliales et les péricytes.

Les DNases dégradent l’ADN.

Ajoutez un tampon contenant de la BSA pour arrêter l’activité enzymatique. Centrifugez et jetez le surnageant.

Remettez les cellules en suspension dans le milieu et plaquez-les sur une plaque multi-puits recouverte d’une matrice de base. Incuber, favorisant l’adhésion cellulaire.

Changez régulièrement de support.

Les cellules endothéliales forment une monocouche et soutiennent la croissance des péricytes.

Le passage cellulaire ultérieur dans un milieu péricytaire sur une plaque multipuits recouverte de gélatine favorise la croissance des péricytes tout en éliminant les cellules endothéliales.

Commencez par placer le cerveau d’une souris mâle C57 black 6 de quatre à six semaines exempte d’agents pathogènes sur une lingette stérile, sèche et non pelucheuse et à l’aide d’une pince à pointe incurvée pour retirer le cervelet, le striatum et les nerfs occipitaux. Utilisez un coton-tige pour enlever toutes les méninges visibles et retournez le tissu cérébral. Ouvrez les lobes avec de légers mouvements vers l’extérieur et retirez tous les vaisseaux sanguins visibles. Ensuite, placez le tissu cérébral sans méninges dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant 15 millilitres de tampon de lavage à froid B.

Pour homogénéiser le tissu, transférez l’échantillon de cerveau dans un tube de mortier Dounce Tissue Grinder et ajoutez 3 à 4 millilitres de tampon de lavage B dans le tube. À l’aide d’un pilon lâche, hachez le mouchoir 55 fois. Ensuite, rincez le pilon avec le tampon de lavage B et hachez la boue de tissu avec un pilon serré 25 fois. À la fin de l’homogénéisation, aliquote également la suspension entre deux tubes de 50 millilitres et ajouter 1,5 fois le volume de sérum bovin froid à 30 % d’albumine dextran. Ensuite, secouez vigoureusement les tubes pour mélanger la boue.

Pour isoler la fraction vasculaire, sédimentez les cellules par centrifugation et transférez les surnageants dans deux nouveaux tubes. Stockez les granulés dans le tampon de lavage B sur de la glace. Remettez les granulés en suspension dans trois millilitres de tampon de lavage à froid B sur de la glace.

Centrifugez les surnageants récoltés et répétez cette étape une fois de plus. Jetez les surnageants et remettez les granulés en suspension dans 3 millilitres de tampon de lavage B. Ensuite, mettez en commun les granulés remis en suspension et portez le volume final des suspensions cellulaires regroupées à 10 millilitres avec le tampon de lavage B à froid frais.

De plus, dissociez les cellules à l’aide d’une pipette de 10 millimètres six fois jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’amas de granulés visibles, et utilisez un ensemble de filtre à vide et une crépine en nylon pour filtrer la suspension cellulaire. Placez la passoire dans une boîte de Pétri et nettoyez le grillage avec du tampon de lavage B frais et en grattant pour récupérer les capillaires. Ensuite, effectuez une deuxième filtration avec un filtre frais.

Répartissez le filtrat à parts égales entre deux tubes et collectez les cellules par centrifugation. Après avoir jeté les surnageants, regroupez les granulés dans un seul tube contenant le tampon de lavage B préchauffé avec des enzymes et ajoutez de la dispase de collagénase préchauffée dans le tube. Placez le tube dans un bain-marie sur une table vibrante pendant précisément 33 minutes à 37 degrés Celsius avant d’arrêter la réaction avec 30 millilitres de tampon de lavage à froid B.

Récupérez les cellules par centrifugation et jetez soigneusement le surnageant. Rapidement mais soigneusement, remettez le granulé en suspension dans le tampon de lavage B six fois et centrifugez à nouveau la suspension. Après avoir jeté le surnageant, remettre la pastille en suspension dans des millilitres de milieu DMEM complet et ensemencer 2 millilitres de suspension cellulaire dans du DMEM complet dans neuf puits de trois plaques à six puits recouvertes de Matrigel.

Placez les cultures cellulaires dans un incubateur stérile à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures avant de retirer soigneusement les débris de chaque puits et ajoutez un milieu DMEM frais. Après 48 heures, changez le milieu dans chaque puits toutes les 48 heures. Du 8e au 10e jour, lorsque les cellules atteignent 100 % de confluence, faites passer les cellules dans le milieu de culture parasitaire sur de nouvelles plaques à six puits recouvertes de gélatine et retournez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 6 à 7 jours supplémentaires avec surveillance.