Obtention d’une suspension unicellulaire à partir de tissu hippocampique de souris
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 3:42 min • July 8th, 2025
Prenez des fragments d’hippocampe de souris adultes perfusés dans un tube de dissociation contenant de la papaïne et de la DNase.
Placez le tube sur un dissociateur mécanique.
Le dissociateur désintègre mécaniquement les tissus, relâchant les cellules, y compris les neurones et les cellules gliales.
La papaïne décompose la matrice extracellulaire du tissu, libérant des cellules. La DNase dégrade l’ADN contaminant.
Ajouter un tampon contenant de la BSA, inactivant les enzymes.
Passez la suspension dans une crépine pour enlever les gros débris.
Centrifuger le filtrat. Jetez le surnageant riche en enzymes.
Remettez les cellules en suspension dans le tampon et transférez-les dans un tube frais.
Ajoutez un média à gradient de densité, mélangez et superposez le mélange avec un tampon.
Lors de la centrifugation, les cellules et les débris forment des couches distinctes en fonction de leur densité.
Retirez la couche tampon supérieure et la couche intermédiaire de débris.
Ajoutez du tampon à la couche inférieure contenant les cellules et mélangez. Centrifuger et jeter le surnageant contenant le milieu à gradient de densité.
Remettre en suspension les cellules de l’hippocampe dans un tampon pour une analyse plus approfondie.
À l’aide d’une pince, transférez les morceaux de tissu de l’hippocampe dans un tube C et ajoutez 30 microlitres de mélange d’enzymes 2 dans le tube. Après avoir tourné le capuchon et serré jusqu’à ce qu’il s’enclenche, placez le tube dans un dissociateur et exécutez le programme approprié. Pendant que le programme est en cours, pré-mouillez une crépine à cellules de 70 microns placée sur un tube conique de 50 millilitres avec 2 millilitres de tampon BSA.
Une fois le programme de dissociation terminé, ajoutez 4 millilitres de tampon BSA au tissu dissocié et filtrez le mélange à travers la passoire cellulaire sur le tube conique de 50 millilitres. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de DPBS dans le tube C. Fermez ensuite le tube, faites tourner doucement la solution et filtrez-la à travers la crépine de cellule sur le tube conique de 50 millilitres. Centrifuger la suspension de cellules filtrées. Jetez le surnageant sans déranger la pastille et stockez la pastille.
Pour l’élimination des débris, remettez la pastille en suspension avec 1 550 microlitres de DPBS froid et transférez la suspension dans un tube conique de 15 millilitres étiqueté. Ensuite, ajoutez 450 microlitres de solution d’élimination des débris froids et pipetez de haut en bas. Recouvrir doucement la suspension cellulaire avec 1 millilitre de DPBS froid, en maintenant l’embout contre la paroi du tube conique. Répétez la procédure jusqu’à ce que le revêtement total soit de 2 millilitres.
Ensuite, centrifugez la suspension à 3 000 fois g pendant 10 minutes avec une accélération maximale et un freinage complet. Aspirez la couche supérieure. Ensuite, balayez l’extrémité de la pipette d’avant en arrière pour aspirer la couche intermédiaire blanche. Retirez autant de couche intermédiaire que possible sans déranger la couche inférieure. Ensuite, ajoutez 2 millilitres de DPBS froid et pipetez de haut en bas pour mélanger. Ensuite, centrifugez la suspension à 1 000 fois g pendant 10 minutes avec une accélération maximale et un freinage complet. Après la centrifugation, jetez le surnageant et remettez le granulé en suspension dans un tampon BSA de 1 millilitre.
Aperçu
Cet article décrit un protocole d'isolement de cellules hippocampiques à partir de tissu de souris adulte en utilisant une dissociation enzymatique et une centrifugation sur gradient de densité. La méthode vise à obtenir des neurones et des cellules gliales viables pour des analyses ultérieures.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Génie tissulaire
Contexte
- L'hippocampe est essentiel pour l'apprentissage et la mémoire.
- L'isolement de cellules à partir de l'hippocampe permet une étude détaillée de la fonction neuronale.
- La dissociation enzymatique est une méthode courante pour l'isolement cellulaire.
- La centrifugation en gradient de densité permet de séparer les cellules en fonction de leur densité.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour isoler les cellules hippocampiques.
- Garantir la viabilité des neurones et des cellules gliales isolées.
- Faciliter l'analyse expérimentale ultérieure de ces cellules.
Méthodes utilisées
- Dissociation mécanique des tissus à l'aide d'un dissocieur.
- Traitement enzymatique à la papaine et à la DNase afin de dégrader la matrice extracellulaire.
- Centrifugation en gradient de densité pour séparer les cellules des débris.
- Filtration à travers un tamis cellulaire pour éliminer les particules grossières.
Résultats principaux
- Isolation réussie de neurones et de cellules gliales hippocampiques viables.
- Démonstration de l'élimination efficace des débris et des contaminants.
- Optimisation du protocole pour améliorer le rendement cellulaire et la viabilité.
- Mise en place d'une méthode reproductible pour les études futures.
Conclusions
- Le protocole décrit est efficace pour isoler les cellules hippocampiques.
- Il fournit une base pour des recherches ultérieures sur la fonction neuronale.
- De futures études pourront s'appuyer sur cette méthode pour explorer divers aspects des neurosciences.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Obtenir des suspensions viables de cellules individuelles à partir de tissus complexes comme l'hippocampe est essentiel pour les applications en aval dans la validation de cibles et le criblage phénotypique. Ce protocole permet l'isolement reproductible de neurones et de cellules gliales, soutenant ainsi la réduction des risques mécanistiques dans la découverte de médicaments en neurosciences. La méthode fournit un système pertinent pour évaluer les effets des composés sur la fonction cellulaire et la modulation des voies métaboliques.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation des cibles neuronales et gliales de l'hippocampe dans un microenvironnement proche du milieu naturel.
- Valeur opérationnelle : Produit des cellules hautement viables, adaptées aux tests fonctionnels et aux études d'engagement des cibles.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère une population cellulaire purifiée pour des résultats d'analyse cohérents et une variabilité réduite.
- Valeur opérationnelle : Les étapes de filtration et de centrifugation assurent l'élimination des débris, améliorant la fiabilité et la reproductibilité à grande échelle des analyses.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Fournit un système pertinent pour l'étude des mécanismes d'apprentissage et de mémoire, facilitant l'alignement des biomarqueurs.
- Valeur opérationnelle : La centrifugation en gradient de densité permet la séparation de cellules viables des contaminants, soutenant des protocoles précliniques reproductibles.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du test d'hypothèses ciblées au développement de tests, en fournissant une étape fiable de préparation cellulaire pour la validation fonctionnelle.
- Découverte en biologie : Soutient la vérification d'hypothèses en produisant des neurones et des cellules gliales hippocampiques viables pour l'analyse de voies biologiques.
- Criblage : Fournit une suspension standardisée et exempte de débris, permettant un criblage fiable de composés.
- Analytique : Permet des mesures quantitatives en aval, telles que l'expression de marqueurs ou l'électrophysiologie.
- Recherche translationnelle : Assure la continuité préclinique en reliant l'isolement hippocampique à la production de cellules viables et fonctionnelles.
- Réutilisation en milieu industriel : Le protocole de dissociation et de purification est adaptable à différents types de tissus nerveux, favorisant la réutilisation de la plateforme.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en fournissant des cellules neuronales pertinentes sur le plan physiologique.
- Valeur opérationnelle : Des étapes enzymatiques et mécaniques standardisées améliorent la reproductibilité entre les différents sites.
- Valeur stratégique : Réduit le bruit biologique dans les tests, favorisant de meilleures décisions « aller/ne pas aller » lors de la validation des cibles.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles en fonction des réponses fonctionnelles des cellules hippocampiques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des tissus et l'optimisation de la dissociation enzymatique.
- Dépend de l'accès à un dissociateur mécanique, à des filtres à cellules et à du matériel de centrifugation.
- Exige une standardisation des concentrations enzymatiques et des durées de dissociation entre les utilisateurs.
- L'adaptation à d'autres régions cérébrales peut nécessiter des ajustements du mélange enzymatique et de la force mécanique.
- L'activité résiduelle des enzymes doit être complètement inactivée afin d'éviter des dommages cellulaires post-dissociation.
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Dernière mise à jour : 22 août 2026