JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 3:43 min • July 8th, 2025
Prenez une configuration d’éclairage latéral à lumière douce contenant un panneau acrylique équipé de tampons blancs et de lumières LED blanches installées sur un bord.
Placez devant une plaque multipuits à faible adhérence contenant un milieu de formation de corps embryoïde.
Ajoutez les corps embryoïdes, ou EB, dans l’assiette.
La lumière LED pénètre par le côté du panneau acrylique et émet des faisceaux parallèles, éclairant latéralement les EB et permettant une visualisation à l’œil nu.
Faites pivoter la plaque pour induire un flux tourbillonnant, faisant converger les EB vers le centre.
Remplacez le milieu usagé par un milieu de formation EB frais.
Prélevez les EB à l’aide d’une pointe de pipette à large calibre.
Tenez la pipette à la verticale pour permettre aux EB de se déposer par gravité.
Transférez les EB dans une autre plaque à faible adhérence contenant un milieu d’induction neurale.
Touchez la pointe à point. Les EB coulent en raison de la tension superficielle du liquide.
Des facteurs spécifiques dans le milieu initient la différenciation neuronale dans les EB, formant une couche neuroépithéliale.
Utilisez un panneau acrylique transparent d’une épaisseur de 0,3 à 0,5 centimètre de la taille d’un papier A5 et collez des tampons blancs à l’avant et à l’arrière de la plaque acrylique. Ensuite, installez une rangée de lumières blanches LED sur le bord de la plaque afin que les lumières puissent entrer par le côté de la plaque acrylique, puis sortir en parallèle.
Maintenant, préparez une nouvelle plaque à six puits à faible adhérence et ajoutez 2 millilitres de milieu de formation EB à chaque puits. Après avoir retiré les EB avec le fluide, à l’aide d’une pointe de pipette à large alésage de 1000 microlitres, transférez environ 100 EB par puits sur la plaque à faible adhérence à 6 puits.
Pour remplacer chaque jour le milieu de formation EB par le même volume de milieu frais, induisez un flux tourbillonnant en faisant pivoter la parabole le long d’une orbite circulaire. Les EB ou organoïdes convergent vers le centre du puits en raison de l’écoulement secondaire généré par la rotation. Aspirez lentement l’ancien milieu en le pipetant lentement jusqu’au bord du puits. Ne sucez pas trop fort, sinon les EB seront retirés ensemble. Ensuite, ajoutez un nouveau support pour remettre les EB en suspension.
Pour l’induction neurale, préparez une nouvelle plaque à 6 puits à faible adhérence avec 3 millilitres de milieu d’induction neurale par puits. Allumez la lumière douce latérale et éteignez les autres sources de lumière intérieures. Maintenant, transférez les EB dans la plaque à 6 puits avec un milieu d’induction neurale ajouté en utilisant une pointe de pipette à large bouche pour aspirer à la fois les EB et le milieu de culture. Ensuite, tenez la pipette à la verticale. Les EB vont progressivement s’enfoncer sous l’effet de la gravité et converger vers l’embouchure de la pointe de la pipette.
Lorsque l’embouchure de la pointe de la pipette touche à nouveau la surface du liquide, et en raison de la tension superficielle du liquide, les EB s’enfoncent rapidement dans le fluide. Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius et à 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures.