Préparation d’un substrat micropatterned pour étudier les phénotypes des cellules de Schwann

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurosciences

0 vues • 3:38 min • July 8th, 2025

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Prenez une plaquette de silicium avec des micromotifs de la géométrie souhaitée pour faire pousser des cellules dans une forme définie.

Versez un mélange de polymères dessus et laissez-le se solidifier.

Découpez un tampon carré du polymère.

Enduisez la surface à motifs du tampon d’une couche de protéines, ce qui facilite la fixation des cellules.

À l’aide d’un courant d’air, éliminez les protéines non liées.

Prenez une lamelle recouverte de polymère.

Placez le côté à motifs du tampon dessus.

Appuyez sur le tampon pour transférer le motif. Retirez le tampon.

Transférez la lamelle dans un puits contenant un tensioactif pour recouvrir les surfaces nues. Cela augmente l’hydrophobicité de surface, empêchant l’adhésion cellulaire indésirable.

Retirez le tensioactif et lavez-le avec un tampon de phosphate.

Ajoutez les cellules de Schwann et laissez-les se fixer au micromotif.

Laver avec un tampon pour enlever les cellules non attachées.

Ajouter le milieu de culture et incuber.

Au fur et à mesure que les cellules se développent le long de la surface, elles prennent la forme de micromotifs, ce qui permet d’étudier le phénotype des cellules de Schwann.

Pour préparer un substrat à micromotifs, placez une plaquette de silicium à motifs à l’intérieur d’une boîte de Pétri circulaire de 150 millimètres de diamètre sur 15 millimètres de hauteur et versez du PDMS dégazé sur la plaquette. Solidifiez le PDMS dans un four à 60 degrés Celsius pendant la nuit. Laissez le PDMS refroidir à température ambiante, puis, à l’aide d’un scalpel chirurgical, découpez des tampons de carrés de 30 x 30 millimètres contenant les motifs corrects, en prenant soin de ne pas endommager la plaquette de silicone. Stérilisez les tampons PDMS et les lamelles réglables en les immergeant dans de l’éthanol à 70 % pendant 30 minutes.

Pour confirmer l’efficacité du micromotif, séchez la surface des tampons PDMS à l’aide d’un courant d’air filtré et pipetez une solution BSA de 50 microgrammes par millilitre pour couvrir toute la face à motifs du tampon. Incuber les tampons avec la solution BSA pendant 1 heure à température ambiante pour permettre l’adsorption des protéines, puis sécher les tampons à l’air libre pour éliminer la solution BSA. Utilisez le flux d’air filtré pour sécher la surface des lamelles réglables.

Mettez le côté à motifs du timbre en contact conforme avec la lamelle amovible pour permettre l’absorption de la BSA sur la surface de la lamelle, et appuyez doucement le timbre contre la lamelle pendant 5 minutes. Examinez le micromotif à l’aide d’un microscope à fluorescence avec un filtre FITC. Pour imprimer des zones adhésives plutôt que des motifs fluorescents, remplacez la protéine BSA par de la laminine.

Retirez les tampons des lamelles et transférez-les dans une plaque stérilisée à 6 puits. Ajouter 2 millilitres de solution Pluronic F127 à 0,2 % dans chaque puits pour couvrir la surface de la lamelle et incuber la plaque pendant 1 heure à température ambiante. Aspirez la solution F127 et lavez les lamelles 5 fois avec du PBS, une fois avec le milieu de culture cellulaire, puis ensemencez les cellules Schwann à une densité d’ensemencement de 1 000 cellules par centimètre carré. 45 minutes après l’ensemencement des cellules, retirez le milieu de culture cellulaire et lavez les lamelles deux fois avec du PBS pour éviter que plusieurs cellules n’adhèrent au même schéma. Maintenir les cellules dans l’environnement de culture cellulaire souhaité pendant 48 heures avant la quantification.

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Dernière mise à jour : 22 août 2026