Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 3:45 min • July 8th, 2025
Prenez une racine nerveuse et coupez-la en petits morceaux.
Transférez dans un tube contenant des enzymes digestives et incuberez.
L’enzyme digère la matrice extracellulaire.
Ajoutez un milieu contenant du sérum pour arrêter la digestion.
Pipetez le contenu à plusieurs reprises, puis centrifugez et jetez le surnageant.
Remettez le granulé en suspension.
Passez la suspension dans une passoire pour éliminer les tissus non digérés. Incuber les cellules collectées dans une plaque.
Les fibroblastes et les cellules de Schwann ou SC se fixent à la plaque et se divisent.
Retirez les cellules non attachées. Lavez les cellules attachées avec un tampon de phosphate.
Ajoutez des enzymes digestives pour desserrer les CS sensibles à la digestion. Arrêtez la digestion avec des fluides.
Détachez complètement les SC en ajoutant du support.
Transférez les cellules dans un tube et centrifugez. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un milieu spécifique à la SC.
Transférez les cellules sur une plaque non revêtue et incuberez.
Tous les fibroblastes restants adhéreront, laissant les SC en suspension.
Transférez la suspension sur une plaque revêtue d’une matrice.
Incuber pour l’attachement et la division des cellules de Schwann.
Coupez les nerfs en morceaux de 3 à 5 millimètres avec des ciseaux. Ajoutez 1 millilitre de trypsine à 0,25 % et transférez les morceaux nerveux dans des tubes à centrifuger de 5 millilitres. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 18 à 20 minutes. Ensuite, pour arrêter la digestion, ajoutez 3 à 4 millilitres de DMEM contenant 10 % de sérum de bovin fœtal. Pipetez doucement le mélange de haut en bas, environ 10 fois. Centrifuger à 800 fois g pendant 5 minutes.
Après centrifugation, jeter le surnageant et remettre le précipité en suspension dans 2 à 3 millilitres de DMEM complété par 10 % de FBS. Filtrez la suspension cellulaire à travers un filtre de 400 mailles, puis utilisez la suspension pour inoculer une boîte de Pétri de 60 millimètres. Incuber les boîtes de Pétri pendant 4 à 5 jours à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de dioxyde de carbone.
Lorsque la culture a atteint 90 % de confluence, laver les cellules une fois avec 1X PBS. Ensuite, pour digérer les cellules de Schwann, ajoutez 1 millilitre de trypsine à 0,25 % à 37 degrés Celsius par plat de 60 millimètres. Après 8 à 10 secondes à température ambiante, arrêtez la digestion en ajoutant 3 millilitres de DMEM complété par 10 % de FBS. Pour détacher les cellules de Schwann, soufflez doucement sur les cellules à l’aide d’une pipette.
Vérifiez au microscope que les cellules sont détachées. Ensuite, prélevez le milieu, qui contient les cellules de Schwann, et centrifugez à 800 x g pendant 5 minutes. Jetez le surnageant et remettez le précipité en suspension dans 3 millilitres de milieu. Utilisez la suspension pour inoculer des boîtes de Pétri non codées de 60 millimètres et incubez les boîtes à 37 degrés Celsius pendant 30 à 45 minutes. Transférez le milieu, qui contiendra les cellules de Schwann, dans une boîte moyenne enrobée de poly-L-lysine, et incubez la boîte à 37 degrés Celsius pendant 2 jours.