Préparation de tubes endothéliales cérébraux à partir d’artérioles parenchymateuses de souris

Fixez un cerveau de souris, face ventrale vers le haut, dans une parabole recouverte de polymère de silicium contenant un tampon.

Disséquez une section de tissu de l’hémisphère autour de l’artère cérébrale moyenne, ou MCA, avec le segment de tissu supérieur s’étendant au-delà du point de ramification du cercle de Willis.

Fixez le tissu avec le MCA vers le haut.

Retirez la pie-mère, avec les artérioles, qui se ramifient à partir du MCA.

Fixez la pie-mère avec les artérioles. Disséquez l’artériole et retirez les tissus environnants. Jetez toutes les branches distales.

Incuber l’artériole dans un cocktail d’enzymes protéolytiques pour faciliter la digestion partielle du segment.

Remplacez les enzymes par un tampon et transférez le segment digéré dans une chambre contenant un tampon sur une platine de microscope équipée d’une pipette de trituration.

Pipetez l’artériole à plusieurs reprises pour enlever les adventices relâchées et les cellules musculaires lisses, ce qui permet d’obtenir un tube intact contenant des cellules endothéliales artériolaires.

Placez le côté ventral du cerveau vers le haut dans une chambre contenant une solution de dissection froide pour isoler les artérioles parenchymateuses. Pour isoler les artères parenchymateuses, fixez le cerveau isolé à l’aide de broches en acier et d’une solution de dissection froide dans une boîte de Pétri contenant un revêtement en polymère de silicone infusé de charbon de bois de plus de 50 centimètres de profondeur.

Découpez un rectangle de tissu cérébral des deux hémisphères avec des ciseaux de dissection pointus et alignés autour du MCA, tout en vous assurant que la partie supérieure du segment de tissu dépasse le point de ramification du cercle de Willis. Fixez le tissu cérébral dans la boîte avec le MCA vers le haut à l’aide de broches en acier. Faites soigneusement une incision peu profonde près des broches et retirez la pia avec de petites pinces, en pelant doucement d’une extrémité vers l’autre.

Fixez soigneusement la pie-racine isolée avec des artérioles parenchymateuses ramifiées du MCA dans la boîte avec les épingles, et disséquez soigneusement les artérioles parenchymateuses. Coupez toutes les branches distales restantes et assurez-vous que l’artériole est propre et qu’aucun tissu n’y est attaché. Utilisez cette artère propre et intacte pour la digestion enzymatique. Vous pouvez également couper chaque artère en deux morceaux pour la digestion enzymatique afin de préparer les tubes endothéliaux, si vous le souhaitez.

Pour la digestion partielle des segments artériolaires, placez les segments artériolaires intacts dans 1 millilitre de solution de dissociation dans un tube en verre de 10 millilitres contenant de la papaïne, du dithioérythritol, de la collagénase et de l’élastase. Incuber les segments artériolaires à 34 degrés Celsius pendant 10 à 12 minutes.

Pour isoler le tube endothélial artériolaire, placez la pipette de trituration fixée avec l’injecteur de microseringue dans la solution de dissociation dans la chambre et positionnez-la près d’une extrémité du segment de vaisseau digéré. Réglez un débit compris entre 1 et 3 nanolitres par seconde sur le contrôleur de la pompe pour une durée de traitement douce. Tout en maintenant un grossissement de 100 à 200 fois, prélevez le segment artériel dans la pipette, puis injectez pour dissocier les cellules adventices et musculaires lisses. Triturez le segment vasculaire jusqu’à ce que toutes les cellules musculaires lisses soient dissociées et que seules les cellules endothéliales restent sous forme de tube intact.