Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines dans les neurones à l’aide de lentivirus modifiés

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurosciences

0 vues • 3:21 min • July 8th, 2025

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Traitez les cellules souches pluripotentes humaines adhérentes avec des lentivirus modifiés dans un réactif de transfection.

Le virus porte des gènes de résistance aux antibiotiques et du facteur de transcription neurogène, contrôlés par les éléments régulateurs et sensibles à la tétracycline.

Le réactif de transfection chargé positivement améliore la fusion virale et la libération de son contenu.

L’ARN viral se transcrit inversement dans l’ADN et s’intègre dans l’ADN des cellules souches, permettant l’expression d’éléments régulateurs qui produisent des protéines activatrices.

Ajoutez un milieu basal avec un dérivé de tétracycline, qui forme un complexe avec les protéines activatrices.

Ce complexe se lie à l’élément sensible à la tétracycline, favorisant l’expression des gènes et produisant les facteurs de transcription neurogènes qui induisent la différenciation des cellules souches en neurones.

Ajoutez un milieu basal avec un médicament antibiotique pour éliminer les cellules non transfectées.

Traitez les cellules avec une solution de détachement contenant des enzymes protéolytiques qui dégradent la matrice extracellulaire ou ECM et libèrent les cellules.

Retirez les enzymes et replaquez les cellules sur des puits recouverts d’ECM avec un milieu de maturation, favorisant ainsi la maturation neuronale.

Deux jours avant l’induction de la différenciation, détachez les cellules ES en ajoutant 1 millilitre de solution de décollement cellulaire et laissez incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Transférez les cellules dans un tube. Ensuite, lavez le puits avec 2 millilitres de média et ajoutez-le dans le même tube. Centrifugez les cellules à 300 fois g pendant 5 minutes. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans le milieu et plaquez les cellules sur des plaques à six puits recouvertes de matrice à la densité de 1 fois 10 à la cinquième cellule par puits.

Le lendemain, ajoutez les lentivirus exprimant Ngn2 plus PuroR et le transactivateur de tétracycline avec du polybrène dans un milieu d’entretien de cellules ES frais. Au jour zéro, ajoutez 2 microgrammes par millilitre de doxycycline dans un milieu DMEM/F12 complété par N2 et sans morphogènes. Le premier jour, ajoutez de la puromycine dans du DMEM/F12 frais plus N2 et de la doxycycline à la concentration finale de 1 microgramme par millilitre.

Sélectionnez les cellules transduites dans la puromycine pendant au moins 24 heures. Le deuxième jour, détachez les neurones différenciateurs avec une solution de détachement cellulaire et replaquez-les sur des plaques à 24 puits recouvertes d’une solution matricielle. Maintenez-les en milieu NBA/B27 sans doxycycline. Cultivez des neurones induits purs sur des plaques recouvertes de solutions à base de matrice extracellulaire.

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Dernière mise à jour : 15 août 2026