Différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en une population de neurones en réseau

Ensemencez des cellules souches embryonnaires de souris dans une boîte à faible attachement contenant un milieu de différenciation.

Incuber en rotation pour faciliter l’agrégation cellulaire et la différenciation en une lignée neuronale.

Transférez les agrégats dans un tube et laissez-les se déposer par gravité. Jetez le support.

Remettre en suspension et transférer les agrégats dans la boîte d’origine contenant des milieux de différenciation complétés par de l’acide rétinoïque.

L’acide rétinoïque induit l’expression des gènes neuronaux, déclenchant la différenciation en cellules progénitrices neurales.

Transférez les agrégats dans un tube. Retirer le milieu et ajouter de la trypsine pour dissocier les agrégats.

Ajoutez un inhibiteur pour neutraliser la trypsine.

Pipeter à plusieurs reprises pour obtenir une suspension cellulaire homogène. Filtrez la suspension pour éliminer les agrégats.

Centrifugez et retirez le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans le milieu.

Ensemencez les cellules sur une boîte recouverte de polymère pour faciliter l’adhésion des cellules.

Retirez le support. Ajoutez des milieux frais contenant des facteurs de croissance pour favoriser la maturation neuronale et former une population de neurones en réseau.

La différenciation des CSE en neurones commence lors d’un passage cellulaire de routine. Dissociez les ESC comme précédemment, mais incluez une plaque supplémentaire pour la différenciation neuronale. Transférez 350 microlitres de suspension cellulaire dans une boîte de 10 centimètres contenant 25 millilitres de milieu de différenciation.

Placez la parabole sur un agitateur orbital réglé à 30 à 45 tr/min à l’intérieur d’un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, et incubez pendant 48 heures. Après 48 heures, à l’aide d’une pipette de 25 millilitres, transférez les agrégats cellulaires différenciateurs dans un tube conique de 50 millilitres.

Immédiatement après, ajoutez 25 millilitres de milieu de différenciation frais dans la boîte de Pétri. Laissez les agrégats se déposer pendant deux à cinq minutes, produisant une pastille visible d’un à deux millimètres de profondeur. Aspirez soigneusement le fluide, en ignorant les cellules uniques ou les petits agrégats encore en suspension, et utilisez une pipette P1000 pour transférer la pastille de cellule dans la boîte de Pétri. Remettez le plat dans l’agitateur rotatif de l’incubateur. Après 48 heures supplémentaires, répétez la procédure de changement de support. Cette fois, ajoutez 30 millilitres de milieu de différenciation complété par six micromolaires d’acide rétinoïque tout-trans.

Le plomb formé aura maintenant une profondeur de deux à quatre millimètres. Après avoir incubé les cellules comme précédemment, répétez la procédure de changement de milieu avec une supplémentation en acide rétinoïque pour la dernière fois. La pastille aura une profondeur de quatre à huit millimètres à ce stade.

Le lendemain, préparez les surfaces de placage comme indiqué dans la partie écrite du protocole. L’après-midi du jour du placage, décongeler 5 millilitres chacun de milieu de trypsinisation NPC pré-aliquote et 0,1 % d’inhibiteur de trypsine de soja à 37 degrés Celsius. Ensuite, à l’aide d’une pipette de 25 millilitres, transférez les agrégats différenciateurs de la plaque de culture vers un tube conique de 50 millilitres.

Laissez les agrégats reposer pendant trois à cinq minutes, puis aspirez soigneusement le milieu sans déranger le granulé. Ensuite, lavez le granulé avec 5 à 10 millilitres de PBS, et une fois que les agrégats se sont déposés, aspirez le PBS et répétez le lavage. Après le deuxième lavage PBS, ajoutez 5 millilitres de milieu de trypsinisation NPC à la pastille et incubez à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes, en remuant doucement le tube deux à trois fois pendant l’incubation.

Ensuite, ajoutez 5 millilitres d’inhibiteur de trypsine de soja à 0,1 % dans les cellules et mélangez rapidement en inversant. Ensuite, triturez doucement les cellules 10 à 15 fois avec une pipette de 10 millilitres jusqu’à ce qu’une suspension cellulaire relativement homogène soit produite. Filtrez lentement la suspension cellulaire à travers une crépine de cellule de 40 ou 70 microns placée sur un tube conique de 50 millilitres.

Ensuite, une fois que toute la suspension a été filtrée, ajoutez 1 millilitre de milieu N2 dans le filtre pour laver les cellules restantes à travers la crépine. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez pendant six minutes à 200 fois g.

Après avoir aspiré le milieu, sans perturber la pastille, triturez dans 2 millilitres de milieu N2, puis ajoutez le milieu N2 jusqu’à un volume total de 10 millilitres. Centrifugez pendant cinq minutes à 200 fois g. Aspirez le média et répétez le processus de lavage des granulés, en remettant le granulé en suspension dans 10 millilitres de milieu N2.

Prélever une aliquote des cellules et compter à l’aide d’un hémocytomètre, puis répéter la centrifugation. Remettre les cellules en suspension dans un milieu N2 jusqu’à une concentration finale de 1x fois 10⁷ cellules par millilitre, et les déposer à une densité de 150 000 à 200 000 cellules par centimètre carré dans des plats préparés à DIV moins 1, et les placer dans l’incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius. Tenir à jour les RSE conformément aux instructions du protocole écrit.