Séparation magnétique des cellules de Schwann des nerfs sciatiques de souris

Prenez une suspension de cellules et de débris de fibres nerveuses sciatiques de souris digérées par voie enzymatique.

Passez dans une passoire en enlevant les débris.

Centrifuger le filtrat et retirer le surnageant.

Remettez les cellules en suspension dans un milieu contenant du sérum et ensemencez-les sur une plaque de culture recouverte de protéines d’adhésion.

Incuber pour l’adhésion cellulaire. Remplacez le support par un support à cellule Schwann. Incuber pour la formation de monocouches de cellules de Schwann.

Retirez le support et lavez-le avec un tampon. Incuber avec de la trypsine pour détacher les cellules.

Ajoutez un milieu contenant du sérum pour arrêter l’activité enzymatique.

Récupérez les cellules et centrifugez. Jetez le surnageant.

Remettez les cellules en suspension dans un tampon et ajoutez des microbilles magnétiques enrobées d’anticorps.

Incuber pour lier les anticorps aux glycoprotéines des fibroblastes.

Centrifugez et jetez le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans le tampon et chargez-les dans une colonne de séparation magnétique contenant des sphères ferromagnétiques placées dans le champ magnétique du séparateur magnétique.

Le champ magnétique retient les fibroblastes liés aux microbilles, ce qui permet aux cellules de Schwann d’être collectées dans le flux continu.

Transférez les nerfs digérés dans un tube de 50 millilitres pour les centrifuger à 188 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 10 millilitres de DMEM contenant 10 % de FCS et 50 microgrammes par millilitre de gentamicine.

Ensuite, filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de cellule de 100 micromètres. Après une centrifugation à 188 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius, remettre en suspension la pastille avec 4 millilitres de DMEM contenant du FCS et de la gentamicine. Ajoutez 2 millilitres de suspension cellulaire dans chacune des deux boîtes de culture tissulaire de 60 millimètres enrobées de poly-L-lysine et de laminine. Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, en laissant les plaques intactes pendant 2 jours dans l’incubateur.

Centrifugez la suspension de cellules Schwann à 188 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius et remettez en suspension la pastille de cellules dans 90 microlitres de tampon de séparation magnétique des cellules par 1 x 10⁷ cellules. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de microbilles Thy-1 par 1 x 10⁷ cellules. Incuber la solution remise en suspension pendant 15 minutes dans l’obscurité à 8 degrés Celsius.

Ensuite, ajoutez 2 millilitres de tampon de séparation magnétique des cellules à la suspension cellulaire. Après une centrifugation à 300 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius, remettre la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon de séparation magnétique des cellules. Placez la colonne de séparation magnétique des cellules dans le séparateur de cellules et humidifiez la colonne avec 1 millilitre de tampon de séparation magnétique des cellules. Ensuite, appliquez-y les cellules pour recueillir le flux.