Une technique pour isoler des noyaux de cellules non neuronales dans le gyrus denté de l’hippocampe

Prélever du gyrus denté dans le cerveau d’une souris dans un tampon d’homogénéisation froid.

Se dissocier mécaniquement pour libérer les neurones, les cellules gliales et les cellules souches.

Le détergent doux du tampon perméabilise les cellules, libérant des noyaux et d’autres organites.

Filtrez l’homogénat pour éliminer les débris de tissu. Ensuite, centrifugez, retirez les organites et remettez-les en suspension dans le tampon d’homogénéisation pour lyser les cellules intactes.

Centrifugez à nouveau, retirez le surnageant contenant les organites libérés et remettez les noyaux en suspension dans un tampon de lavage.

Filtrez pour éliminer tous les débris, centrifugez et retirez le surnageant.

Introduisez une coloration fluorescente de l’ADN pour marquer tous les noyaux et un anticorps conjugué au fluorophore qui se lie à l’antigène nucléaire neuronal, ou NeuN, marquant les noyaux des neurones.

À l’aide du tri des noyaux activés par fluorescence, identifiez les agrégats ayant une intensité de fluorescence de coloration d’ADN plus élevée et des propriétés de diffusion plus élevées, en séparant les noyaux uniques.

Analyser les noyaux uniques, en séparant les noyaux neuronaux NeuN-positifs et en isolant les noyaux NeuN-négatifs appartenant aux cellules gliales et souches.

Homogénéisez le tissu avec 10 coups de pilon A lâche, suivis de 15 coups de pilon B serré. Transférez l’homogénat dans un tube pré-refroidi de 15 millilitres. Rincez l’homogénéisateur Dounce avec 1 millilitre de HB froid, et combinez-le avec le même tube.

Ajoutez 3 millilitres de HB dans le tube de 15 millilitres et incubez pendant 5 minutes sur de la glace. Mélangez cette suspension de noyaux deux fois en inversant doucement le tube. À l’aide de 0,5 millilitre de HB, pré-mouiller le capuchon de la crépine de 70 micromètres placé sur un tube à essai de 50 millilitres. Ensuite, filtrez la suspension de noyaux avant de laver la crépine cellulaire avec 0,5 millilitre de HB.

Ensuite, retirez la crépine de la cellule et centrifugez le tube à essai dans une centrifugeuse à godet pivotant à 500 g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius. Jetez le surnageant. Remettez doucement la pastille en suspension dans 4 millilitres de HB à l’aide d’une pipette P1000.

Après cinq minutes d’incubation sur glace, centrifuger la suspension à 500 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 3 millilitres de produit de lavage. Utilisez 0,5 millilitre de produit de lavage pour pré-mouiller un capuchon de crépine de 35 micromètres sur un tube à essai de 50 millilitres. Ensuite, filtrez la suspension de noyaux en pipetant 0,5 millilitre de suspension à la fois à l’aide d’une pipette P1000.

Après avoir lavé le capuchon de la passoire avec 0,5 millilitre de produit de lavage, placez le tube sur de la glace. Transférez le filtrat dans un nouveau tube de 15 millilitres et centrifugez-le pendant 5 minutes et 4 degrés Celsius à 500 g. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 3 millilitres de produit de lavage.

Répétez la centrifugation et remettez en suspension la pastille dans 1 millilitre de produit de lavage avec l’anticorps anti-Neu de souris et l’anticorps conjugué à AlexaFlour488 et 1 microgramme par millilitre de DAPI. Incuber la réaction pendant 45 minutes sur de la glace dans l’obscurité.

Pour le tri des noyaux activés par fluorescence ou FANS, transférez la suspension de noyaux immunocolorés dans un tube à essai de 5 millilitres et placez-la sur de la glace jusqu’au début de la procédure de cytométrie en flux.

Manipulez les échantillons pendant trois secondes avec une légère intensité avant de placer les tubes dans l’instrument FACS.

Pour obtenir les données de la suspension des noyaux de colorant, réglez les portes en hauteur DAPI et en zone DAPI pour exclure les débris cellulaires et les noyaux agrégés. Ensuite, placez les portes dans la zone de diffusion latérale logarithmique ou SSC et dans la zone de diffusion directe logarithmique ou FSC pour séparer les noyaux uniques de l’agrégat ou des débris cellulaires restants colorés au DAPI.

Ensuite, isolez la population négative à NeuNAF488 en posant les portes pour la zone anti-NeuNAF488 et FSC.

Après l’analyse, triez la population négative à l’anti-NeuNAF488 dans un tube de collecte de 1,5 millilitre rempli de 50 microlitres de produit de lavage en utilisant la stratégie de porte.