Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 2:59 min • July 8th, 2025
Prenez des bactéries génétiquement modifiées sur un milieu de croissance de nématodes.
Les bactéries portent un plasmide avec un gène de facteur de régulation de la chromatine du nématode.
Le milieu contient un inducteur qui déclenche l’expression d’une ARN polymérase transgénique à partir du génome bactérien qui transcrit le gène du facteur de régulation de la chromatine en un ARNdb.
Ajoutez des larves de nématodes transgéniques portant un gène de facteur de transcription induisant le destin des neurones sous un promoteur de choc thermique.
Lors de la consommation bactérienne, l’ARNdb ingéré génère un siRNA qui régule à la baisse l’expression du facteur de régulation de la chromatine, facilitant ainsi la reprogrammation du destin cellulaire.
À travers les cellules germinales des parents, l’ARNi est transmis à la descendance.
La régulation négative de l’expression du facteur régulateur de la chromatine dans les cellules germinales de la descendance, indiquée par un phénotype vulvaire saillant, permet leur reprogrammation.
Appliquez un choc thermique à la descendance, en activant le promoteur du choc thermique et en exprimant le facteur de transcription induisant le destin des neurones qui déclenche la différenciation neuronale, transformant les cellules germinales en neurones.
Les neurones expriment une protéine rapporteure fluorescente transgénique, facilitant la visualisation microscopique.
Transférez manuellement 50 vers L4 par répétition sur une plaque d’ARNi NGM. Utilisez un fil de platine. Les vers L4 sont reconnaissables à une tache blanche à peu près à mi-chemin le long de leurs faces ventrales. Maintenant, incubez les vers à 15 degrés Celsius dans l’obscurité pendant environ sept jours. L’IPTG est sensible à la lumière.
Lorsque la progéniture F1 atteint les stades L3 et L4, séparez-la des animaux parentaux plus gros et plus épais. À ce stade, dépister le phénotype de la vulve saillante dans le F1, ce qui indique que l’ARNi contre lin-53 a été couronné de succès. L’activité de l’ARNi peut également entraîner une létalité, qui augmente au-dessus de 15 degrés Celsius. Pour activer G1 et induire la conversion des cellules germinales en neurones dans la descendance F1, envoyez un choc thermique aux vers pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans l’obscurité. Utilisez un incubateur ventilé, car il permet un choc thermique plus efficace.
Après le choc thermique, incubez des assiettes à 25 degrés Celsius pendant la nuit dans l’obscurité. Il est important d’éviter d’induire une surexpression de Q1 par choc thermique avant que les animaux n’atteignent le stade intermédiaire L3. Cela peut conduire à l’expression de la protéine Q1 dans des tissus non ciblés. Le lendemain, installez une source lumineuse à fluorescence et un filtre GFP pour examiner les animaux à la recherche d’une fluorescence dérivée du transgène dans la zone du milieu du corps.