Différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l’homme en cellules de type microglie

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Neurosciences

0 vues • 4:03 min • July 8th, 2025

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Commencez par une plaque multi-puits à faible adhérence contenant des cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans un corps embryoïde ou un milieu EB.

Centrifugeuse pour décanter les cellules. Incuber pour favoriser la prolifération et l’agrégation cellulaires, formant des corps embryoïdes.

Les régulateurs de la lignée cellulaire favorisent la différenciation cellulaire en progéniteurs myéloïdes.

Collectez ces EB et transférez-les sur le bord d’une matrice extracellulaire ou d’une plaque revêtue d’ECM.

Remplacez le milieu par un précurseur primitif de macrophage ou un milieu de différenciation PMP et agitez doucement. Incuber pour faciliter l’attachement des CE à l’ECM.

Remplacez la moitié du milieu et incubez.

Les facteurs de croissance hématopoïétiques poussent les progéniteurs myéloïdes à se différencier en précurseurs primitifs de macrophages, qui se séparent des EB et apparaissent dans le milieu.

Collectez ces PMP et faites tourner les cellules. Remettez-les en suspension dans un milieu de différenciation microgliale.

Ensemencez ces cellules dans une plaque multipuits recouverte de laminine et incuberez.

Les PMP utilisent les facteurs de différenciation et les nutriments, se différenciant en cellules de type microglie, un type de cellule immunitaire du cerveau.

Pour le placage des cellules, ajoutez 100 microlitres de cellules diluées par puits dans une plaque à fond rond à 96 puits à faible adhérence. Centrifugez la plaque à 125 fois g pendant trois minutes et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant quatre jours.

Le jour 2, à l’aide d’une pipette multicanaux, remplacez l’ancien milieu demi-EB par un milieu frais. Pour générer des précurseurs primitifs de macrophages ou PMP, enduisez les puits d’une plaque à 6 puits en ajoutant 1 millilitre de solution d’enrobage de matrigel glacée. Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant deux heures ou toute la nuit.

Au jour 4 de la différenciation des EB, à l’aide d’une pointe de pipette de 1 millilitre, transférez les EB dans les puits recouverts de matrigel. Pipette de haut en bas pour déloger les EB du puits. Ensuite, tenez la plaque inclinée pour permettre aux EB de se déposer au bord du puits.

Une fois que tous les EB se sont installés, pipetez doucement et remplacez l’ancien milieu tout en gardant les EB au bord du puits avec 3 millilitres de milieu complet PMP fraîchement préparé. Répartissez uniformément les cellules dans les puits en déplaçant manuellement les plaques d’un côté à l’autre et de l’arrière vers l’avant. Ensuite, incubez la plaque pendant sept jours pour permettre aux EB de se fixer au fond du puits.

Après sept jours, inspectez les EB sous un microscope à champ lumineux à un grossissement de 4 fois pour vous assurer qu’ils sont fixés au fond des puits. Effectuez un demi-changement de médium et, le 21e jour, remplacez le milieu complet par 3 millilitres de milieu complet PMP.

Le 28e jour, recherchez des cellules rondes appelées PMP dans le surnageant. Ensuite, prélevez le milieu contenant les PMP à l’aide d’une pipette de 10 millilitres et d’une pipette automatique sans perturber les EB.

Transférez les PMP dans le milieu dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez les PMP collectés à 200 fois g pendant quatre minutes et aspirez le surnageant avant de les remettre en suspension dans 1 à 2 millilitres de cellules de type microglie ou de milieu basal IMG.

Ensuite, comptez les cellules sur l’hémocytomètre, comme décrit précédemment. Centrifugez le reste des cellules et diluez les PMP à la concentration souhaitée. Ensuite, plaquez les cellules à une densité de 10à 5 cellules par centimètre carré sur des plaques traitées en culture cellulaire à l’aide d’un milieu complet IMG fraîchement préparé.

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Dernière mise à jour : 15 août 2026