Obtention de diverses populations de cellules neurales à partir d’un hippocampe de rat

Prenez des fragments d’hippocampe de rat perfusés.

Incuber avec de la papaïne pour digérer la matrice extracellulaire du tissu et détacher les cellules, y compris les neurones, les astrocytes et la microglie.

Ajouter DNase et mélanger.

Dissocier mécaniquement le tissu à l’aide de pipettes de diamètres progressivement décroissants pour obtenir une suspension unicellulaire. Incuber pour que la DNase dégrade l’ADN contaminant.

Passez la suspension dans une passoire en enlevant les débris.

Ajouter un tampon contenant des ions divalents pour arrêter l’activité enzymatique.

Centrifugez et retirez le surnageant riche en enzymes.

Maintenant, ajoutez un tampon et des billes magnétiques anti-myéline. Incuber pour que les billes lient les débris de myéline.

Après l’incubation, centrifugez et retirez le surnageant.

Remettez le mélange en suspension dans le tampon et chargez-le sur une colonne de séparation magnétique contenant des sphères ferromagnétiques placées dans le champ magnétique du trieur magnétique.

Le champ magnétique retient les débris de myéline liés aux billes magnétiques dans la colonne tandis que les cellules sans myéline passent à travers.

Lavez la colonne avec un tampon et récupérez le flux contenant les neurones, les astrocytes et la microglie.

Commencez la dissociation neurale en utilisant des lames de rasoir stériles pour découper chaque échantillon prélevé sur des tissus cérébraux adultes en petits morceaux de 30 à 400 milligrammes sur le couvercle d’une plaque de culture à six puits. Plongez ensuite le tissu dans 1 millilitre de HBSS sans calcium ni magnésium, et utilisez une pipette pour transférer les échantillons dans des tubes à centrifuger stériles de 2 millilitres.

Lorsque tous les tissus ont été prélevés, centrifugez les échantillons, aspirez les surnageants et incubez les échantillons pendant 15 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius, en inversant le tube plusieurs fois toutes les cinq minutes pour remettre en suspension les morceaux de tissu déposés.

À la fin de l’incubation, ajoutez 30 microlitres de tube d’enzymes mélangées fraîchement préparées à chaque échantillon et retournez doucement les tubes. Puis, à l’aide d’une pipette Pasteur marquée 1, dissocier chaque échantillon par 30 triturations ascendantes et descendantes en prenant soin d’éviter de générer des bulles. Incuber les échantillons pendant 15 minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius avec inversion toutes les cinq minutes, suivie d’une dissociation des échantillons avec la pipette Pasteur numéro 2, comme nous venons de le démontrer.

Ensuite, passez à la pipette numéro 3. Répétez la dissociation et incubez les échantillons pendant 10 minutes de plus dans le bain-marie, avec inversion toutes les cinq minutes. À la fin de l’incubation, filtrez les suspensions unicellulaires à travers des crépines de cellules de 80 microns dans des tubes Falcon de 15 millilitres, en lavant chaque passoire avec 10 millilitres de HBSS sans calcium ni magnésium pour arrêter les réactions enzymatiques. Lorsque le dernier échantillon a été filtré, faites tourner les tubes et aspirez les surnageants.

Pour épuiser la myéline des suspensions cellulaires, remettez soigneusement les granulés en suspension dans 400 microlitres de tampon d’élimination de la myéline et ajoutez la quantité appropriée de billes d’élimination de la myéline dans chaque tube. Pipetez les solutions de haut en bas jusqu’à ce que les cellules et les billes soient bien mélangées. Ensuite, incubez l’échantillon à 4 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après l’incubation, laver chaque échantillon dans 5 millilitres de tampon d’élimination de la myéline.

Pendant que les cellules tournent, placez une colonne pour chaque échantillon dans le champ magnétique d’un trieur magnétique, et placez un filtre propre de 80 microns sur chaque colonne. Rincez trois fois chaque filtre et chaque colonne avec 1 millilitre de tampon d’élimination de la myéline, en recueillant tout le flux dans un conteneur à déchets.

Après le rinçage final, placez des tubes de polystyrène à fond rond de 5 millilitres directement sous chaque colonne pour recueillir l’éluat. Ensuite, aspirez le surnageant des échantillons et remettez les granulés en suspension dans 500 microlitres de tampon d’élimination de la myéline.

Appliquez immédiatement les suspensions de cellules sur les colonnes, en recueillant les cellules dans les tubes situés en dessous. Ensuite, rincez chaque filtre et chaque colonne 4 fois avec 1 millilitre de tampon d’élimination de la myéline par lavage. Après le dernier lavage, faites tourner les cellules et aspirez les surnageants.