JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 5:29 min • July 8th, 2025
Récoltez des moelles épinières de souris et coupez-les en fragments.
Transférez les fragments dans un tube contenant une enzyme protéolytique et de la DNase. Vortex et incuber.
L’enzyme digère la matrice extracellulaire du tissu, tandis que la DNase dégrade l’ADN libre contaminant.
Vortex à nouveau et pipette à plusieurs reprises pour compléter la dissociation tissulaire, obtenant une suspension unicellulaire.
Centrifugez et retirez le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans une solution contenant de la DNase et un inhibiteur de protéase, et vortex. L’inhibiteur neutralise l’enzyme.
Superposez la solution inhibitrice fraîche sur le dessus, centrifugez et retirez le surnageant.
Remettez les cellules en suspension dans un milieu à gradient de densité, un vortex, puis centrifugez.
Les cellules se déposent en bas, tandis que les débris de myéline restent en haut.
Jetez les débris. Laver à plusieurs reprises avec un tampon, centrifuger et retirer le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans le milieu de croissance.
Plaquez les cellules. La surface non revêtue facilite la fixation des cellules gliales.
Retirez le milieu épuisé et ajoutez-y un milieu frais pour induire la prolifération des cellules gliales, établissant ainsi une culture gliale mixte.
En travaillant dans une cagoule de culture tissulaire, transférez quatre moelles épinières de souris dans une boîte de Pétri de HBSS. Utilisez des ciseaux stériles et des pinces pour couper chacune des moelles épinières en petits morceaux. Ensuite, transférez les morceaux dans un tube conique de 50 millilitres contenant un mélange d’enzymes papaïne DNase. Évitez de transférer le HBSS dans le mélange d’enzymes, car cela pourrait entraîner une diminution des performances de l’enzyme.
Il est crucial que les morceaux de tissu soient bien digérés pour obtenir une suspension unicellulaire. Cependant, une digestion excessive entraînera une diminution du nombre de cellules viables. Chaque laboratoire doit effectuer des tests pilotes pour déterminer le temps exact de digestion en fonction de ce qui fonctionne le mieux pour ses cellules.
Ensuite, faites tourbillonner doucement le tube, puis incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure avec une secousse orbitale à 150 rotations par minute. Après l’incubation, faites un vortex dans le tube, puis triturez vigoureusement le tissu à l’aide d’une pipette de 5 millilitres pour favoriser une dissociation supplémentaire. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et centrifugez à 300 fois g pendant 5 minutes à température ambiante.
Pendant la centrifugation, ajouter 300 microlitres de solution d’inhibiteur d’albumine ovomucoïde reconstituée à 2,7 millilitres d’EBSS dans un tube stérile et bien mélanger. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de solution DNase. Après la centrifugation, retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans la solution d’inhibiteur d’albumine ovomucoïde et de DNase fraîchement préparée. Bien vortex pour casser la pastille de cellule.
Ensuite, ajoutez 3 millilitres de solution d’inhibiteur d’albumine ovomucoïde reconstituée sans DNase à la suspension cellulaire. Centrifugez les cellules à 70 fois g pendant 6 minutes à température ambiante. Après l’essorage, retirez le surnageant qui contient des fragments de membrane et conservez la pastille.
Pour éliminer la myéline des cellules dissociées de la moelle épinière, ajoutez d’abord 8 millilitres de milieu à gradient de densité de 20 % à température ambiante dans le tube contenant la pastille cellulaire et vortex doucement. Ensuite, centrifugez les cellules à 800 fois g pendant 30 minutes à température ambiante sans les casser. Après la centrifugation, aspirez soigneusement la couche supérieure de débris, qui contient principalement de la myéline, et le surnageant sortant de la pastille.
Pour éliminer tout gradient de densité restant, lavez les cellules en remettant en suspension la pastille avec 8 millilitres de cDMEM dilué avec HBSS. Centrifugez les cellules à 400 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Retirez le surnageant et lavez les cellules avec du cDMEM dilué comme précédemment.
Après avoir retiré le surnageant, la pastille peut être stockée sur de la glace jusqu’à l’ensemencement des cellules. Une fois prêts pour le placage, remettez les cellules en suspension dans 14 millilitres de cDMEM complété par du 2-Mercaptoéthanol, et ajoutez 1 millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits dans une plaque à 12 puits.
Plaquez des puits supplémentaires qui peuvent être utilisés pour déterminer le nombre moyen de cellules par puits et le contenu microglial de la culture. Une fois les cellules plaquées, incubez les cellules à 35,9 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Changez le milieu le jour 1, c’est-à-dire le lendemain du placage.
Certaines cellules sont attachées à la plaque de culture, mais elles sont encore principalement rondes. Il y a aussi de nombreuses cellules flottantes et d’importants débris. Répétez le changement de support trois à quatre jours plus tard.