Différenciation des progéniteurs otiques multipotents immortalisés en neurones ganglionnaires spiralés et évaluation de la différenciation

Prenez une plaque multipuits contenant des lamelles stériles recouvertes d’un substrat de culture cellulaire.

Introduire des progéniteurs otiques multipotents immortalisés, ou iMOP, dans un milieu de différenciation neuronale.

Les iMOP sont des précurseurs de diverses cellules de l’oreille interne, y compris les neurones ganglionnaires spiralés, ou SGN, qui transmettent des informations auditives au cerveau.

Incuber, permettant aux cellules d’adhérer au substrat. Le milieu induit une différenciation des iMOP en SGN.

Ajoutez un fixateur pour induire la réticulation des protéines, préservant ainsi la morphologie cellulaire, et une solution détergente pour perméabiliser les membranes cellulaires.

Introduire un réactif bloquant pour éviter l’étiquetage non spécifique.

Ajoutez des anticorps conjugués aux fluorophores spécifiques des marqueurs de différenciation neuronale et incubez, permettant aux anticorps de marquer les SGN.

Lavez pour éliminer les anticorps non liés et fixez les lamelles avec un milieu de montage contenant une coloration nucléaire fluorescente.

À l’aide de la microscopie à fluorescence, détectez les signaux d’anticorps pour confirmer la différenciation des iMOPs en SGN.

Tout d’abord, nettoyez les lamelles rondes en verre en les plaçant dans une plaque stérile de 100 millimètres et en les immergeant dans de l’éthanol à 70 %. Agitez doucement les lamelles pour vous assurer qu’elles sont couvertes et laissez le plat à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, rincez les lamelles trois fois dans du PBS stérile, puis une fois avec de l’eau stérile.

Ensuite, laissez sécher les lamelles en les exposant à la lumière UV dans une hotte de culture tissulaire pendant 15 minutes. Pour une utilisation immédiate, placez une lamelle stérile dans chaque puits d’une plaque à 24 puits et secouez doucement la plaque pour vous assurer que toutes les lamelles reposent à plat. Ensuite, enduisez les lamelles en ajoutant 0,25 millilitre de 1x PBS contenant 10 microgrammes par millilitre de poly-D-lysine dans chaque puits.

Après que la plaque ait incubé pendant une heure à 37 degrés Celsius, retirez la solution de poly-D-lysine et lavez les puits trois fois avec du 1x PBS stérile. Une fois que le liquide du dernier lavage a été aspiré, introduisez 0,25 millilitre de 1x PBS contenant 10 microgrammes par millilitre de laminine dans chacun des 24 puits. Après avoir incubé la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius, aspirez la solution de laminine. Ensuite, lavez chaque puits avec 1 millilitre de 1x PBS trois fois, mais laissez le PBS du dernier lavage dans les puits jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à être plaquées.

Pour commencer la différenciation neuronale, comptez les cellules des otosphères dissociées comme décrit précédemment, puis mettez-les en suspension dans un milieu de différenciation neuronale préchauffé. Procéder par l’ensemencement de 1 et 1,5 x 10^cellules 5 iMOP dans chaque puits de la plaque contenant les lamelles revêtues. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone, en remplaçant le milieu de différenciation neuronale tous les deux jours.

Après sept jours, aspirez le milieu et fixez les cellules, qui doivent être fixées aux lamelles, en ajoutant 4 % de formaldéhyde dans chaque puits et en les laissant pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, retirez le formaldéhyde et lavez les cellules une fois dans 1x PBS contenant 0,1 % de Triton X-100. Ensuite, retirez le tampon de lavage et ajoutez un tampon de blocage composé de 1x PBS contenant 10 % de sérum de chèvre normal et 0,1 % de Triton X-100 dans chaque puits.

Laissez les cellules pendant une heure à température ambiante, puis retirez le liquide et remplacez-le par un tampon de blocage contenant la dilution appropriée de l’anticorps Cdkn1b ou Tubb3. Après une incubation d’une nuit à 4 degrés Celsius, laver les cellules une fois avec 1x PBS contenant 1 % de Triton X-100, puis procéder à l’immunocoloration comme décrit précédemment. Une fois la coloration terminée, effectuez un dernier lavage en ajoutant 1x PBS dans les puits.

Pour les préparer à l’analyse, retirez les lamelles auxquelles les cellules de coloration sont fixées de la plaque à 24 puits et placez-les sur un support de montage sur une lame de verre. Après avoir laissé sécher le milieu de montage pendant la nuit à 4 degrés Celsius, obtenez des images d’épifluorescence comme décrit précédemment.