Culture ex vivo et imagerie de tranches oculomotrices d’embryons de souris transgéniques

Prenez une souris transgénique enceinte, isolez chirurgicalement l’utérus contenant des embryons et lavez-le pour éliminer le sang résiduel.

Retirez les embryons contenant des motoneurones marqués par fluorescence et transférez-les dans le couvercle d’une plaque multipuits.

Ajoutez de l’agarose fondue et refroidissez le couvercle pour induire la formation de gel, en intégrant les embryons.

Sous un microscope à fluorescence, alignez les noyaux oculomoteurs et les yeux en ligne et coupez l’agarose parallèlement à la ligne.

Fixez un embryon sur un stade d’échantillon et placez-le dans une chambre de vibratome remplie d’un tampon de tranchage à froid.

À l’aide du vibratome, générez des tranches contenant les noyaux oculomoteurs et les yeux. Les noyaux forment les nerfs oculomoteurs qui contrôlent les mouvements oculaires.

Transférez les tranches sur des inserts de culture à l’intérieur d’une plaque multipuits contenant un milieu de culture et incuber.

À l’aide d’un microscope à fluorescence, imagez à intervalles réguliers pour observer les neurones oculomotrices marqués par fluorescence qui étendent les axones jusqu’aux yeux.

Avant de commencer la procédure, confirmez d’abord la grossesse par échographie le jour embryonnaire 10.5 à partir d’un accouplement chronométré. Récoltez les embryons, vaporisez l’abdomen de la souris enceinte avec de l’éthanol à 70 % et utilisez des ciseaux pour ouvrir la cavité abdominale afin d’extraire l’utérus. Lavez l’utérus dans une boîte de Pétri de HBSS glacée avant de placer l’organe dans une deuxième boîte de Pétri de HBSS fraîche et glacée.

À l’aide d’un microscope à dissection, retirez les embryons de la corne utérine et de leurs sacs amniotiques individuels, en plaçant chaque embryon sur la face inférieure du couvercle d’une plaque à 12 puits sur de la glace au fur et à mesure de la récolte. Utilisez du papier filtre pour éliminer tout liquide entourant chaque embryon sans toucher les embryons eux-mêmes, et immergez les embryons dans de l’agarose liquide à 4 % à faible point de fusion.

Placez le couvercle de l’assiette sur de la glace pour solidifier l’agarose. Lorsque l’agarose est durcie, retournez les embryons et recouvrez l’autre côté de chaque échantillon avec de l’agarose supplémentaire. Lorsque le deuxième volume d’agarose s’est solidifié, utilisez un microscope à dissection de fluorescence pour couper l’agarose autour de chaque embryon afin que chaque embryon soit correctement orienté sur l’étage du vibratome.

Les noyaux oculomoteurs et les excroissances axonales précoces doivent être fluorescents. Alignez chaque embryon de manière à ce que le noyau, les axones sortants et l’œil forment une ligne, et utilisez une lame de rasoir pour couper l’agarose parallèlement à cette ligne. Ensuite, remplissez une chambre de vibratome avec un tampon de tranche glacé et supercollez le premier embryon au stade de vibratome afin que la lame soit parallèle au noyau oculomoteur et aux yeux.

Lorsque la super colle est sèche, immergez l’étage de vibratome de manière à ce que l’embryon soit orienté vers l’opposé de la lame, et utilisez une nouvelle lame vibratone pour obtenir des tranches de 400 à 450 micromètres. À l’aide d’une pipette de transfert stérile, chaque tranche est transférée dans un tampon de tranchage à froid au fur et à mesure de son acquisition, et à l’aide du microscope à dissection de fluorescence, la sélection de la tranche contenant les noyaux oculomoteurs et les yeux.

À l’aide d’une pipette de transfert stérile, transférez la tranche sur une culture cellulaire, insérez-la dans une plaque à 6 puits contenant 1,5 millilitre de milieu de culture par puits et placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Retirez l’agarose résiduelle de l’étage inférieur et collez l’embryon suivant sur l’étage, en continuant à recueillir les tranches jusqu’à ce que tous les embryons aient été sectionnés et plaqués, et image des tranches toutes les 30 minutes par microscopie à contraste de phase et à fluorescence jusqu’à 72 heures.