Génération d’une puce de barrière hémato-encéphalique à l’aide de cellules précurseurs dérivées d’iPSC

Prenez une puce microfluidique avec des canaux superposés, recouverts d’une matrice, séparés par une membrane poreuse.

Cellules neurales progénitrices dérivées d’iPSC dans le canal supérieur. Incuber pour l’adhésion cellulaire, puis laver pour éliminer les cellules non attachées.

Ensuite, ensemencez des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales dérivées d’iPSC dans le canal inférieur.

Inversez la puce et incubez-la pour fixer les cellules endothéliales du côté de la membrane du canal inférieur.

Ensuite, retournez la puce pour attacher les cellules sur le côté inférieur du canal, formant une structure monocouche en forme de tube. Lavez les deux canaux avec un support spécifique à la cellule.

Écoulement continu d’un milieu de différenciation neurale dans le canal supérieur et d’un milieu de cellules endothéliales dans le canal inférieur.

Les cellules endothéliales utilisent des facteurs de croissance du milieu pour arriver à maturité et forment des jonctions serrées ressemblant à un vaisseau sanguin, formant le côté sanguin.

Les facteurs neurotrophiques entraînent la différenciation des cellules progénitrices neurales en diverses cellules cérébrales, formant le côté cérébral. Ces cellules interagissent avec les cellules endothéliales, créant une barrière hémato-encéphalique sur la puce.

Pour commencer, apportez le plat contenant les chips préparées dans l’armoire de biosécurité. À l’aide d’une pipette P200, lavez délicatement les deux canaux en ajoutant 200 microlitres de milieu de différenciation neurale dans l’entrée et en retirant le liquide de la sortie. En évitant tout contact avec les ports, aspirez soigneusement les gouttelettes de support en excès de la surface de la puce.

Agitez doucement la suspension cellulaire pour assurer une suspension cellulaire homogène. Pour ensemencer les cellules neurales progénitrices dérivées d’iPSC dans le canal supérieur afin de générer le côté cerveau, ajoutez une pointe P200 contenant 30 à 100 microlitres de suspension cellulaire à la concentration de 1 x 10⁶ cellules par millilitre à l’entrée du canal supérieur, et relâchez doucement la pointe de la pipette.

Prenez une pipette P200 vide pour appuyer sur le piston, insérez-la dans la sortie du canal supérieur et tirez délicatement la suspension unicellulaire à travers la pointe. Transférez la puce au microscope pour vérifier la densité d’ensemencement dans une distribution homogène des cellules dans le canal supérieur. Après avoir confirmé la densité cellulaire à 20 % de couverture, placez immédiatement les puces dans l’incubateur pendant deux heures à 37 degrés Celsius.

Après cela, lavez les cellules qui ne se fixent pas en ajoutant un nouveau milieu de différenciation neurale dans l’entrée et en accumulant le liquide à l’aide d’une pipette à partir de la sortie. Maintenez les cellules dans des conditions statiques à 37 degrés Celsius avec un remplacement quotidien du milieu de différenciation neurale. Une fois que les iNPC se sont attachés ou le jour suivant l’ensemencement, apportez le plat contenant les copeaux préparés à l’armoire de biosécurité. Lavez délicatement le canal inférieur avec 200 microlitres de milieu de cellules endothéliales.

En évitant tout contact avec les ports, aspirez soigneusement les gouttelettes de milieu de cellule endothéliale en excès de la surface de la puce, en vous assurant de laisser le milieu dans les deux canaux. Agitez doucement la suspension cellulaire pour assurer une suspension cellulaire homogène. À l’aide d’une pipette P200, prélevez 30 à 100 microlitres de suspension de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales dérivées d’iPSC à une concentration de 14 à 20 x 10⁶ cellules par millilitre, et placez l’embout dans l’entrée du canal inférieur.

L’étape la plus critique pour obtenir des propriétés de barrière fonctionnelle est l’ensemencement des cellules endothéliales microvasculaires du cerveau. Il est crucial d’ensemencer les cellules à la bonne densité pour éviter la formation de bulles afin de vérifier la distribution homogène dans la gaine de l’organe.

Appuyez sur le piston d’une pipette P200 avec une pointe vide, insérez-la dans la sortie du canal inférieur et relâchez lentement le piston de la pipette pour tirer délicatement la suspension unicellulaire à travers le canal inférieur. Aspirez l’excès de suspension cellulaire de la surface de la puce. Évitez tout contact direct avec les orifices d’entrée et de sortie pour vous assurer qu’aucune suspension de cellule n’est aspirée hors des canaux. Transférez la puce au microscope pour vérifier la densité de semis.

Le canal inférieur est rempli de cellules sans espace observable entre les deux. Après avoir confirmé la densité cellulaire correcte, ensemencez les cellules dans les puces restantes. Pour fixer les cellules sur la membrane poreuse, située au-dessus du canal inférieur, inversez chaque puce et laissez-les reposer dans un berceau à puces. Placez un petit réservoir contenant du DPBS stérile à l’intérieur de la parabole de 150 millimètres pour fournir de l’humidité aux cellules.

Incuber les copeaux à 37 degrés Celsius pendant environ trois heures ou jusqu’à ce que les cellules du canal inférieur se soient fixées. Une fois que les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales dérivées d’iPSC se sont fixées, retournez les puces en position verticale pour permettre la fixation des cellules à la partie inférieure du canal inférieur. 48 heures après l’ensemencement des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales dérivées d’iPSC, équilibrer la température du milieu cellulaire endothélial en le réchauffant dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Ensuite, dégazez le milieu par incubation sous un système de filtration sous vide pendant 15 minutes. Ensuite, désinfectez l’extérieur de l’emballage et des plateaux du module portable avec de l’éthanol à 70 %, essuyez-les et transférez-les dans l’enceinte de biosécurité. Ouvrez l’emballage et placez les modules dans le plateau. Orientez-les avec les réservoirs vers l’arrière du plateau. Pipetez 3 millilitres du milieu chaud pré-équilibré dans chaque réservoir d’entrée. Ajoutez un milieu de culture cellulaire endothéliale au réservoir d’entrée du canal inférieur et un milieu de différenciation neurale au réservoir d’entrée du canal supérieur du canal supérieur.

Ensuite, pipetez 300 microlitres du média chaud pré-équilibré dans chaque réservoir de sortie directement au-dessus de chaque orifice de sortie. Placez jusqu’à 6 modules portables sur chaque plateau. Amenez les plateaux dans l’incubateur et glissez-les complètement dans le module de culture avec la poignée du plateau vers l’extérieur. Sélectionnez et exécutez le cycle principal sur le module de culture. Fermez la porte de l’incubateur et laissez le module de culture amorcer les modules portables pendant environ une minute.

Le cycle d’amorçage est terminé lorsque la barre d’état indique « Prêt ». Retirez le plateau du module de culture et apportez-le dans l’enceinte de biosécurité. Inspectez le dessous de chaque module portatif dans l’enceinte de biosécurité pour vérifier que les modules portatifs ont été amorcés avec succès. Recherchez la présence de petites gouttelettes aux quatre ports. Si aucun module portable ne présente de gouttelettes, relancez le cycle d’amorçage sur ces modules. Si un fluide a coulé sur le plateau, ce qui se produit plus souvent par les orifices de sortie, nettoyez le plateau avec de l’éthanol à 70 %.

Ensuite, lavez délicatement les deux canaux de chaque puce avec un milieu de culture spécifique à la cellule équilibré chaud pour éliminer toute bulle possible dans le canal, et placez de petites gouttelettes de milieu sur le dessus de chaque orifice d’entrée et de sortie. Insérez les puces avec les supports dans les modules portables et placez-en jusqu’à six sur chaque plateau. Insérez les plateaux dans le module de culture. Programmez les conditions de culture de puce d’organe appropriées, telles que le débit et l’étirement sur le module de culture. Dès que le cycle Regulate est terminé, ce qui dure environ deux heures, les conditions programmées commencent. Après cela, le module de culture commence à s’écouler dans les conditions de culture prédéfinies de la puce d’organe.