Isolement et culture de cellules à partir de télencéphales dorsolatéraux d’embryons de souris

Prenez un embryon de souris dans un tampon et séparez le crâne pour isoler le cerveau.

Retirez les méninges, la couche membraneuse qui recouvre le cerveau.

Disséquez le cerveau pour séparer les hémisphères.

Isolez les télencéphales dorsolatéraux des hémisphères et transférez-les dans un tube.

Les télencéphales dorsolatéraux sont riches en neurones et en cellules progénitrices neurales.

Centrifugez et retirez le surnageant.

Ajouter une solution enzymatique. Les enzymes décomposent la matrice tissulaire, relâchant les cellules.

Introduisez un milieu de prolifération contenant du sérum. Les protéines sériques inhibent l’activité enzymatique.

À l’aide d’une pipette, dissociez mécaniquement le tissu, formant une suspension cellulaire.

Centrifugez et retirez le surnageant contenant des enzymes inactivées et des débris tissulaires.

Remettre les cellules en suspension dans le milieu de prolifération.

Transférez les cellules sur une microplaque recouverte d’un substrat de culture cellulaire.

Incuber pour que les cellules adhèrent au substrat. Le milieu facilite la prolifération des cellules progénitrices.

Commencez par prélever le cerveau de 5 à 10 embryons E14 dans une boîte de Pétri avec un milieu de dissection froid. À l’aide d’une pince, retirez soigneusement la peau et le crâne et isolez le cerveau. Pendant que vous travaillez sous le stéréomicroscope, utilisez une pince à dissection pour enlever les méninges. Ensuite, divisez le télencéphale en milieu pour séparer les hémisphères.

Pour isoler le télencéphale dorsolatéral coupé le long de la courbe dorsomédiale et de la limite palliale-sous-palliale. Transférez le télencéphale dorsolatéral dans un tube de 2 millilitres avec un moyen de dissection sur de la glace jusqu’à ce que tous les cerveaux soient disséqués. Après la microdissection du télencéphale dorsolatéral, placez le tissu dans un tube conique de 15 millilitres.

Ensuite, centrifugez le tube contenant le tissu collecté et le milieu de dissection à froid pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius et 340 fois g pour précipiter le tissu. Après l’essorage, retirez le surnageant à l’aide de la pipette et ajoutez 1 millilitre de trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius 0,05 % pour la digestion chimique. Incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius.

Après l’incubation, ajoutez 2 millilitres de milieu de prolifération pour inhiber l’activité de la trypsine. Ensuite, polissez la pointe d’une pipette Pasteur en verre sur un brûleur à gaz ou un bec Bunsen pendant quelques secondes pour réduire légèrement l’ouverture. Aspirer le FCS pour enrober l’extrémité de la pipette. Ensuite, dissociez mécaniquement les cellules avec la pipette Pasteur polie au feu et recouverte de FCS en pipetant de haut en bas en faisant attention à ne pas générer de bulles.

Centrifugez les cellules dissociées pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius et 340 fois g. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette. Ensuite, ajoutez 1 millilitre de milieu de prolifération et remettez les cellules en suspension à l’aide d’une pipette. Retirez le PBS de la plaque prétraitée avec de la poly-D-lysine. Ensuite, dessinez un signe sur le bas de la plaque qui peut être utilisé comme référence pour déterminer le point zéro.

Après avoir remis les cellules en suspension dans le milieu de prolifération pour la deuxième fois, préparez une dilution de 1 à 1 de la suspension cellulaire à l’aide d’une solution de bleu de trypan à 0,4 %. Chargez dans les lames de la chambre de comptage et comptez le nombre de cellules viables non colorées. Les cellules non viables seront bleues. Diluez les cellules dans un milieu de prolifération pour obtenir 10^{à 6} cellules par millilitre. Ajoutez 500 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits et incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.