Etablissement d’une culture cellulaire de ganglions de la racine dorsale primaire à partir d’une colonne vertébrale de rat

Prenez une colonne vertébrale de rat. Faites deux coupes sur ses côtés et une coupe latérale.

Retirez les muscles dorsaux et la partie dorsale des vertèbres.

Extrayez la moelle épinière.

Identifiez les ganglions de la racine dorsale, ou DRG, situés bilatéralement le long des vertèbres lombaires.

Les DRG contiennent des neurones entourés de cellules gliales.

Accise les DRG et rassemble-les dans un plat. Lavez le mouchoir à plusieurs reprises avec un milieu sans sérum.

Transférez les DRG dans une plaque contenant une solution de collagénase et incuberez. La collagénase dégrade la matrice extracellulaire.

Laver avec un tampon. Ajoutez de la trypsine-EDTA et incubez pour perturber les jonctions cellule-cellule, relâchant ainsi les cellules.

Transférez les DRG dans un tube, centrifugez-le et jetez le surnageant.

Remettez le tissu en suspension dans le milieu de culture et pipetez à plusieurs reprises pour libérer les cellules.

Transférez bien les cellules sur une plaque de culture recouverte de polymère pour faciliter la fixation.

Retirez le milieu et ajoutez-y un milieu frais contenant des inhibiteurs et des facteurs de croissance.

Les inhibiteurs limitent la prolifération des cellules gliales, tandis que les facteurs de croissance favorisent la croissance neuronale.

Prélevez les ganglions de la racine dorsale lombaire du tronc d’un rat âgé de deux à trois semaines. Commencez par faire deux coupes le long des côtés de la colonne vertébrale et une coupe latérale pour marquer l’extension rostrale de la colonne lombaire. Ensuite, utilisez une pince à couper les os pour retirer les muscles dorsaux de la colonne vertébrale. Ensuite, retirez la partie dorsale des vertèbres et exposez la moelle épinière, puis utilisez des ciseaux de dissection et des pinces pour retirer la moelle épinière.

Identifiez le DRG lombaire en comptant les vertèbres à partir de la dernière côte. Ce schéma montre les positions des vertèbres. À l’aide de micro-ciseaux, prélever les 12 DRG lombaires bilatéraux de L1 à L6. Retirez toutes les fibres neuronales attachées pour améliorer la pureté de la culture. Transférez chaque DRG lombaire dans une boîte de culture de 35 millimètres contenant 2 millilitres de milieu glacé sans sérum.

Transférez le plat de 35 millimètres contenant du DRG dans un capuchon laminaire et lavez le DRG avec un milieu sans sérum trois fois à l’aide d’une pipette. À l’aide d’une pince à épiler stérile, déplacez les DRG dans une nouvelle boîte de culture de 35 millimètres contenant 2 millilitres de collagénase stérile de type 1A. Placez le tissu dans une solution de collagénase dans l’incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour commencer la dissociation des cellules.

Après l’incubation, retirez la solution de collagénase et lavez le DRG trois fois dans 2 millilitres de la solution saline équilibrée de Hank. Ensuite, ajoutez 2 millilitres de trypsine-EDTA préchauffée à 0,05 % dans le plat et digérez le DRG dans l’incubateur pendant 30 minutes comme auparavant. Après la digestion, à l’aide d’une pipette en verre, transférez les 2 millilitres de solution contenant du DRG dans un tube à centrifuger de 15 millilitres.

Le DRG peut coller à la pipette en verre, cette étape doit donc être effectuée avec soin. La perte de DRG peut être évitée en maintenant la solution contenant du DRG dans l’extrémité conique de la pipette en verre et en transférant la solution dans le tube de centrifugation lentement mais sans pause.

Ensuite, centrifugez la solution à 290 fois g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius. Après la centrifugation, retirez le surnageant et ajoutez encore 2 millilitres de milieu sans sérum pour remettre le DRG en suspension. Répétez le lavage deux fois en utilisant 2 millilitres de milieu de culture préchauffé pour remettre le tissu en suspension après la centrifugation finale.

À l’aide de la pipette stérile polie à la flamme préalablement préparée, triturer manuellement le DRG environ 60 fois. Ensuite, retirez de l’incubateur à CO2 une plaque de 24 puits recouverte de poly-L-lysine contenant 1 millilitre de milieu de culture par puits. Aspirez le milieu de culture incubé de la boîte.

Ensemencez les cellules DRG d’un rat dans quatre des puits. Cela donne une densité d’ensemencement d’environ 500 000 cellules par puits. Le lendemain, remplacez le milieu de culture par un milieu complété par 10 micromolaires d’AraC et 100 nanogrammes par millilitre de NGF.