Développement et maintien de corps embryoïdes sans sérum

Commencez avec une cellule progénitrice neurale ou des agrégats NPC contenant bien dans les milieux de différenciation-1 ou DM-1.

Ces NPC sont des précurseurs de la lignée neurale générée à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme, ou hiPSC, à l’aide de DM-1 dans des conditions contrôlées.

Transférez les agrégats NPC sur un insert de membrane placé à l’intérieur d’un puits contenant du DM-1 et retirez l’excès de média.

Changez le milieu en DM-2 et incubez.

DM-2 fournit des nutriments et des facteurs de différenciation qui favorisent la maturation des NPC en différents types de cellules neurales.

Les NPC indifférenciés se transforment en corps embryoïdes, connus sous le nom de corps embryoïdes sans sérum ou SFEB, car le milieu manque de sérum. Ces EB ressemblent à la morphologie d’un cerveau en développement.

Transférez l’insert dans un puits contenant du DM-3.

Le DM-3 contient des facteurs de croissance essentiels à l’entretien et à la croissance des SFEB.

Incuber jusqu’à ce que les SFEB atteignent la taille souhaitée.

Après deux semaines de culture des cellules, préparez des plaques à six puits avec des inserts de culture cellulaire de 40 microns et 1 millilitre de milieu DM1. Incuber ces plaques pendant au moins quatre heures avant d’ajouter les cellules cultivées.

Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette à large ouverture de 200 microlitres, prélevez des agrégats de cellules âgés de deux semaines avec environ 20 microlitres de milieu. Transférez quatre à six agrégats sur chaque insert avec un minimum de solution. Retirez tout excédent.

Au cours de cette étape, il est important de travailler rapidement et d’une main ferme. Lors de l’élimination du milieu autour des SFEB, vous pouvez voir les SFEB se déplacer à travers la solution en raison de la tension superficielle. Vous pouvez les repositionner une fois le support retiré.

Une fois que tous les agrégats sont chargés sur des inserts, changez le milieu à 1 millilitre de DM2 et poursuivez la culture des cellules. Tous les deux jours, remplacez les 3/4 du milieu par du milieu frais. Après 14 jours de culture, commencez à ajouter du milieu DM3 aux cultures. Continuez la culture pendant 16 jours de plus pour faire pousser les SFEB.