Génération d’un modèle de co-culture 3D de fibroblastes et de neurones cornéens humains

Prenez les fibroblastes cornéens humains.

Transférez-les dans un insert à membrane à l’intérieur d’une plaque multipuits contenant un support.

Ajoutez du support dans l’insert de membrane. Incuber pour l’adhérence des fibroblastes à l’insert.

Ensuite, remplacez le média par un média contenant de la vitamine C dans l’insert de la membrane et le réservoir.

couver. La vitamine C stimule les fibroblastes à sécréter et à assembler une matrice extracellulaire 3D.

Ajouter une suspension de cellules de neuroblastome humain sur les fibroblastes.

Incuber, permettant l’adhésion des cellules du neuroblastome.

Maintenant, ajoutez un milieu contenant de l’acide rétinoïque sur les cellules et complétez le réservoir avec un milieu frais.

couver. L’acide rétinoïque déclenche la différenciation des cellules du neuroblastome en cellules progénitrices neurales.

Ensuite, retirez le support. Introduisez un média frais dans le réservoir. Ajoutez un milieu contenant un facteur neurotrophique dans l’insert membranaire et incuber.

Les facteurs neurotrophiques déclenchent la différenciation des cellules progénitrices en neurones, générant un modèle de co-culture 3D de fibroblastes et de neurones cornéens humains.

Pour assembler des constructions 3D, il faut d’abord faire passer et compter les fibroblastes cornéens humains. Ensuite, ensemencez environ 1 fois 10 à 6 HCF sur un insert de membrane en polycarbonate avec des pores de 0,4 micron. Ajoutez 1,5 millilitre de milieu frais sur le dessus de la construction. Ensuite, pipetez 1,5 millilitre du même milieu au bas de chaque construction.

Après 24 heures, ajoutez 1,5 millilitre de milieu complété par 0,5 millimolaire de vitamine C en haut et en bas de chaque construction. Incuber à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone pendant trois semaines, en ajoutant un milieu frais contenant de la vitamine C tous les deux jours. Cela stimulera les cellules à sécréter et à assembler leur propre matrice extracellulaire. Après trois semaines, ajoutez 8 fois 10 aux 3 cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y au-dessus des constructions 3D précédemment assemblées.

Il est essentiel de calculer le nombre exact de cellules à cette étape et de prévoir 24 heures avant d’initier la différenciation cellulaire.

Après 24 heures d’incubation, amorcez la différenciation cellulaire SH-SY5Y en stimulant les cellules avec 1,5 millilitre d’EMEM avec 10 % de FBS et 10 micromolaires d’acide rétinoïque. Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre du milieu contenant de la vitamine C au bas de la construction. L’acide rétinoïque est sensible à la lumière, cette étape doit donc être effectuée dans l’obscurité.

Après cinq jours, lorsque les cellules ont atteint la phase de différenciation, ajoutez 1,5 millilitre de milieu sans sérum contenant 2 nanomolaires de BDNF et 1 % d’antibiotique-antimycosique au sommet de la construction. Ajoutez un milieu frais complété en vitamine C au bas de la construction. Cultivez les cellules pendant deux jours supplémentaires avant de les traiter pour une analyse plus approfondie.