JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 3:45 min • July 8th, 2025
Prenez une tranche du tronc cérébral d’une souris contenant le noyau vestibulaire médial, ou MVN.
Fixez la tranche dans une chambre d’enregistrement remplie de liquide céphalo-rachidien artificiel pour maintenir la viabilité neuronale.
Visualisez la coupe au microscope pour localiser les neurones MVN.
Appliquez une pression positive pour faire avancer une micropipette remplie d’une solution imitant l’environnement intracellulaire à travers le tissu.
Lorsque la pipette entre en contact avec un neurone, la membrane neuronale se creuse.
Appliquez une pression négative pour aspirer une petite partie de la membrane, créant ainsi un joint étanche.
Ensuite, appliquez des impulsions de pression négative pour rompre la membrane, créant ainsi une connexion continue entre le neurone et la pipette.
Appliquez des amplitudes de bruit aléatoires au neurone et identifiez une amplitude sous-seuil au-delà de laquelle le bruit induit une décharge neuronale.
Enfin, appliquez une gamme de stimuli électriques au neurone combinée à l’amplitude du bruit aléatoire inférieure au seuil.
Mesurer le gain neuronal – la capacité du neurone à moduler sa réponse de décharge aux stimuli en présence de bruit.
Pour l’électrophysiologie par patch clamp à cellules entières, tirez d’abord sur les micropipettes dont la résistance finale varie de 3 à 5 mégaohms lorsqu’elles sont remplies d’une solution interne à base de potassium, et placez-les dans le bain. Pour obtenir des enregistrements de patch-clamp de cellules entières à partir de neurones individuels dans le MVN, transférez une seule tranche de tissu de la chambre d’incubation à la chambre d’enregistrement d’une installation électrophysiologique standard, et utilisez un fil de nylon sur un poids en forme de U pour fixer la tranche.
Perfuser en continu la chambre d’enregistrement avec de l’aCSF carbogéné à 25 degrés Celsius à un débit de trois millilitres par minute, et remplir une micropipette avec la solution interne. Appliquez une petite quantité de pression positive à l’aide d’une pipette pour éloigner les débris de la pointe de la pipette. À l’aide d’un objectif de puissance inférieure, localisez le MVN avant de passer à une puissance élevée pour localiser des neurones individuels dans le MVN.
Avant de percer le tissu avec la pipette, appliquez une petite quantité de pression positive pour éloigner les débris de la pointe de la pipette et utilisez le micromanipulateur pour déplacer la pipette vers le neurone sélectionné. Une petite fossette doit se former sur la membrane neuronale. Relâchez la pression positive et appliquez une petite quantité de pression négative.
Une fois qu’une étanchéité d’un gigaohm a été obtenue, appliquez une pression négative douce, courte et nette sur le porte-pipette à travers l’orifice d’aspiration pour rompre la membrane et créer une configuration de cellules entières. Ensuite, obtenez des enregistrements de pince de courant de cellule entière conformément aux protocoles standard.
Pour appliquer un bruit stochastique et sinusoïdal à des neurones individuels du noyau vestibulaire médial, réglez la gamme d’amplitudes de 3 à 24 picoampères pour déterminer le seuil neuronal et la vitesse de décharge, et regroupez les intensités de stimulus inférieures et supérieures pour déterminer le seuil sensoriel.
Ensuite, calculez la cadence de décharge moyenne sur la période de 10 secondes pendant laquelle le pas de courant de dépolarisation sera injecté pour chaque niveau de courant individuel. Utilisez les valeurs de cadence de tir moyenne pour générer un graphique de cadence de tir en fonction du graphique actuel. Ensuite, effectuez une analyse de régression linéaire pour déterminer le gradient de la droite de meilleur ajustement pour déterminer le gain neuronal.