JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 2:57 min • July 8th, 2025
Prenez des cellules ganglionnaires rétiniennes de poisson-zèbre cultivées sur des lamelles enduites.
Ces cellules expriment un biocapteur génétiquement codé qui produit la protéine fluorescente verte roGFP2, sensible à l’oxydoréduction, fusionnée à une enzyme sensible au peroxyde d’hydrogène, Orp1.
Transférez la lamelle avec le support dans une chambre d’imagerie de cellules vivantes et placez la chambre sur un microscope inversé.
Remplacez le support par un support sans sérum pour réduire la fluorescence de fond.
En raison des faibles niveaux de peroxyde d’hydrogène, roGFP2 reste dans sa conformation réduite.
Excité séquentiellement le biocapteur aux longueurs d’onde de 405 et 480 nm.
Le roGFP2 réduit présente un pic d’excitation à 480 nm.
Passez à un média contenant du peroxyde d’hydrogène.
Le peroxyde d’hydrogène pénètre dans les cellules et réagit avec Orp1, oxydant le roGFP2.
Excité à nouveau le biocapteur.
Le roGFP2 oxydé présente une augmentation de la fluorescence à 405 nm et une diminution à 480 nm.
Calculez le rapport d’intensité de fluorescence.
Une augmentation du rapport indique une augmentation des niveaux de peroxyde d’hydrogène cellulaire.
Le jour de l’imagerie, vérifiez les cellules au microscope pour valider la croissance des axones RGC. Pour l’imagerie de cellules vivantes, transférez les lamelles de la boîte de culture vers une chambre d’imagerie de cellules vivantes. Utilisez un microscope inversé équipé d’un objectif DIC, d’un filtre rouge passe-long OG590 et d’une caméra EM-CCD.
Avant l’imagerie, remplacez le support ZFCM+ par ZFCM-. Après avoir positionné les cellules avec l’objectif 10x, acquérez des images à un grossissement de 60x à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile. Utilisez un grossissement supplémentaire de 1,5x.
Tout d’abord, acquérez des images DIC, puis des images roGFP2-Orp1 à l’aide d’un jeu de filtres approprié. Après avoir pris la première série d’images, échangez les supports avec des supports contenant différentes solutions de traitement. Le milieu doit être changé toutes les 30 minutes d’imagerie pour éviter les changements de pH et d’osmolarité.