Établissement d’une configuration de cellule entière pour l’imagerie calcique à deux photons de coupes de cerveau

Prenez une pipette de stimulation contenant des fluorophores rouges insensibles au calcium dans du liquide céphalo-rachidien artificiel, ou ACSF.

Positionnez la pipette près du neurone cible dans une tranche d’hippocampe.

Placez une pipette patch avec une électrode d’enregistrement baignée dans un électrolyte contenant des fluorophores indicateurs rouges insensibles au calcium et des fluorophores indicateurs de calcium vert près de la cible.

Appliquez une pression positive constante pour perturber brièvement la surface du tissu, indiquant la proximité de la cible.

Au fur et à mesure que la fossette se forme sur la membrane neuronale, relâchez la pression pour former un joint.

Appliquez une pression négative pour resserrer le joint.

Stabiliser le potentiel de membrane à une tension négative constante.

Continuez avec une pression négative pour briser la membrane, permettant aux électrolytes contenant des fluorophores de se propager dans le neurone.

Visualisez la fluorescence rouge de la colonne dendritique cible et alignez la pipette de stimulation à proximité de celle-ci.

Appliquez des impulsions électriques pour ouvrir les canaux calciques.

Utilisez la microscopie à deux photons pour visualiser les changements transitoires des niveaux de calcium, comme indiqué par la fluorescence verte.

Dans cette étape, transférez une tranche d’hippocampe dans un bain sous l’objectif d’un microscope à deux photons à balayage laser. Perfuser continuellement le bain avec de l’ACSF normal oxygéné. Ensuite, utilisez la microscopie à contraste interférentiel différentiel infrarouge pour localiser une cellule d’intérêt en utilisant sa taille, sa forme et sa position.

Après cela, remplissez une pipette stimulante avec une solution normale ACSF contenant le fluorophore rouge. Abaissez-le sur le dessus de la tranche de manière à ce que la pointe se trouve dans la même région que la cellule d’intérêt. Ensuite, remplissez la pipette patch avec la solution patch et fixez-la à l’étage de tête. Placez-le sur la tranche de manière à ce que sa pointe soit directement au-dessus de la cellule d’intérêt.

Ensuite, insérez une seringue dans le robinet d’arrêt à trois voies et connectez-la à la pipette patch à travers un tube en plastique. Injectez une pression positive constante dans la pipette patch et maintenez le robinet d’arrêt en position fermée. Abaissez la pipette patch jusqu’à ce qu’elle se trouve juste au-dessus de la cellule ciblée. En entrant en contact avec la membrane cellulaire, retirez la pression en tournant le robinet d’arrêt en position ouverte.

Ensuite, appliquez une légère pression négative sur la pipette patch à l’aide d’une seringue vide insérée dans le robinet d’arrêt jusqu’à ce que la résistance de la pipette atteigne 1 giga ohm. Dans la fenêtre de test de membrane du logiciel d’acquisition de données, fixez la cellule à moins 60 millivolts. Continuez à appliquer une pression négative jusqu’à ce que la résistance de la pipette diminue et que la configuration de l’ensemble de la cellule soit obtenue.

Pour enregistrer les transitoires calciques dendritiques induits par la stimulation électrique, localisez une dendrite d’intérêt à l’aide du signal fluorescent rouge. Placez la pipette stimulante sur la surface de la tranche au-dessus de la dendrite d’intérêt. Abaissez lentement la pipette de stimulation à 10 à 15 micromètres de la dendrite, en minimisant les mouvements pour ne pas perturber la configuration de l’ensemble de la cellule.