Enregistrements électrophysiologiques pour l’évaluation des régénérations neuronales dans des coupes de moelle épinière co-cultivées

Prenez un réseau multi-électrodes revêtu de polymère ou MEA, avec des tranches de moelle épinière embryonnaire co-cultivées positionnées dans deux zones distinctes, permettant l’enregistrement simultané des deux tranches.

La tranche montre des connexions neuronales régénérées dans la zone précédemment lésée.

Placez le MEA dans une chambre d’enregistrement contenant une solution extracellulaire riche en ions et en nutriments pour maintenir la survie neuronale.

Permettre au système de se stabiliser, facilitant l’adaptation et la communication des neurones.

Les neurones communiquent via des signaux électriques appelés potentiels d’action, qui sont enregistrés par les électrodes voisines dans le MEA.

Les signaux individuels de chaque électrode sont combinés, produisant un signal électrique à partir de chaque tranche.

Remplacez régulièrement la solution extracellulaire pour maintenir la stabilité des neurones.

Ajoutez une solution extracellulaire avec des inhibiteurs qui bloquent les récepteurs inhibiteurs des neurotransmetteurs sur les membranes neuronales, maintenant les neurones actifs plus longtemps.

Comparez l’activité électrique des deux tranches. Un signal électrique synchronisé entre les deux tranches confirme les connexions synaptiques et la régénération neuronale réussie.

Placez une boîte de Pétri avec un réseau de microélectrodes enrobées à l’intérieur sous un stéréomicroscope. Faites la mise au point sur le réseau et centrez une gouttelette de six microlitres de plasma de poulet sur le réseau d’électrodes. À l’aide d’une petite spatule, glissez avec précaution deux sections de la moelle épinière avec leurs côtés ventraux face à face dans la gouttelette de plasma.

Ensuite, ajoutez huit microlitres de thrombine autour de la gouttelette de plasma de poulet. Ensuite, utilisez l’embout de la pipette pour mélanger et étaler soigneusement le mélange de plasma de poulet et de thrombine. Juste avant que le mélange de plasma de poulet et de thrombine ne devienne trop filandreux et ne commence à coaguler, aspirez l’excès de liquide. Ensuite, bouchez la boîte de Pétri et placez-la dans une chambre humidifiée.

Placez la chambre à l’intérieur d’un incubateur à 37 degrés Celsius pendant environ une heure. Après l’incubation, ajoutez soigneusement 10 microlitres de milieu nutritif à l’échantillon. Fermez la boîte de Pétri et remettez-la dans l’incubateur pendant 45 minutes supplémentaires. Ensuite, placez chacun des assemblages de culture à plusieurs électrodes dans un tube à rouleaux et ajoutez trois millilitres de milieu nutritif. Fermez bien le couvercle et placez le tube du rouleau dans le tambour du rouleau. Faites tourner le tambour à 1 à 2 tr/min dans l’incubateur à 37 degrés Celsius.

À l’aide d’une pince stérile à embout en caoutchouc, retirez les ensembles de culture à plusieurs électrodes du tube à rouleau et placez-les dans une boîte de Pétri sous un stéréomicroscope. Faites la mise au point sur le tissu et vérifiez que les deux tranches sont fusionnées. Ensuite, maintenez l’ensemble stable et placez une lame de scalpel dans la rainure du réseau de multiélectrodes près des tranches de tissu. Tenez le scalpel plutôt horizontalement, puis soulevez le manche du scalpel vers le haut, mais laissez la lame du scalpel rester dans le sillon du réseau de manière à ce que la lame roule de la base à la pointe, coupant à travers le tissu, couvrant le sillon.

Sectionnez toutes les connexions tissulaires résiduelles avec une pointe d’aiguille de calibre 25 si nécessaire. Ne travaillez que dans la zone à l’intérieur de la rainure et ne touchez pas les bords tendres. Remettez les ensembles de culture à réseau multi-électrodes dans le tube à rouleaux et ajoutez trois millilitres de milieu nutritif frais aux cultures. Ensuite, replacez le tube du rouleau sur le tambour à rouleaux dans l’incubateur à 37 degrés Celsius.

Montez un ensemble de culture à plusieurs électrodes dans une chambre d’enregistrement et appliquez environ 500 microlitres de solution extracellulaire sur le réseau. Ensuite, montez l’ensemble sur le microscope. Attendez 10 minutes que le système se stabilise, puis enregistrez l’activité spontanée de base de chacune des électrodes de détection d’activité pendant 10 minutes. Répétez les enregistrements deux fois au total.

Pour garantir des conditions extracellulaires stables, remplacez la solution extracellulaire après chaque session d’enregistrement. Si vous le souhaitez, désinhibez le réseau en appliquant une solution extracellulaire contenant une micromolaire de strychnine et 10 micromolaires de gabazine et attendez au moins deux minutes avant d’enregistrer l’activité électrique.