Induire des varicosités axonales avec un stimulus micromécanique sur les neurones
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 3:04 min • July 8th, 2025
Commencez par fixer une micropipette avec le tube attaché à un micromanipulateur.
Fixez l’autre extrémité du tube à une seringue remplie d’un tampon de sel via un connecteur avec une valve tournante.
Réglez la seringue à une hauteur qui fournit une pression suffisante pour induire des varicosités dans les axones.
Les varicosités axonales sont des gonflements en forme de perles qui se produisent sur toute la longueur d’un axone.
Positionnez la micropipette à l’angle souhaité par rapport à la boîte de culture.
Utilisez la lumière fluorescente du microscope pour aligner la pointe de la micropipette et abaissez-la près de la surface de la boîte de culture cellulaire contenant un tampon de sel.
Maintenant, allumez la lumière transmise et désactivez le filtre fluorescent.
Placez une lamelle avec des neurones sur la parabole.
Tout d’abord, concentrez-vous sur la micropipette et ajustez sa position.
Ensuite, concentrez-vous sur la région contenant les neurones cibles.
Ouvrez la vanne pour appliquer la pression du fluide. Ce stimulus micromécanique induit des varicosités dans ces neurones.
Dans cette procédure, insérez la pipette dans le haut de la vis du micromanipulateur pour la maintenir en place. Inclinez la pipette à un angle de 45 degrés avec la surface par rapport à la boîte de culture cellulaire. Activez le filtre de fluorescence. Ouvrez l’ouverture et assurez-vous qu’un point fluorescent peut être vu à travers l’objectif.
À l’aide du micromanipulateur, déplacez la pipette dans une position qui aligne la pointe avec le point fluorescent, et abaissez la pipette dans une position juste au-dessus de la hauteur de la boîte de culture cellulaire. Une fois qu’il est en position, allumez la lumière transmise et désactivez la fluorescence. À l’aide d’une pince à épiler, transférez une lamelle avec les cellules tournées vers la pipette de la plaque de culture cellulaire à la boîte de culture cellulaire contenant 2 millilitres de tampon de Hank à température ambiante.
À l’aide du bouton de mise au point fine et de l’objectif 20 fois, faites la mise au point sur un plan à environ quatre tours complets au-dessus des cellules. Ensuite, à l’aide du micromanipulateur, positionnez la pointe de la pipette de manière à ce qu’elle soit focalisée et au centre du côté gauche du plan, comme on le voit à travers les oculaires. Une fois la pipette en place, focalisez le microscope sur un plan qui contient la région d’intérêt.
Dans l’imagerie de 7DIV, les neurones de l’hippocampe de souris transfectés par GFP ont montré un axone avant et après l’inhalation.
Aperçu
Cet article décrit une méthode permettant d'induire des varicosités axonales dans les neurones à l'aide d'une micropipette et d'une pression fluide. La procédure implique un positionnement précis de la micropipette et l'application d'un tampon salin pour stimuler les neurones.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Techniques de micromanipulation
Contexte
- Les varicosités axonales sont des gonflements de forme perlée situés le long des axones.
- L'induction de varicosités peut aider à l'étude de la fonction et de la connectivité neuronales.
- Les techniques de micropipette sont couramment utilisées en neurobiologie.
- L'imagerie fluorescente facilite la visualisation des structures neuronales.
Objectif de l'étude
- Démontrer une méthode pour induire des varicosités axonales dans des neurones en culture.
- Fournir un protocole détaillé à destination des chercheurs en neurosciences.
- Approfondir la compréhension de la morphologie et du comportement neuronals.
Méthodes utilisées
- Fixer une micropipette à un micromanipulateur.
- Relier la micropipette à une seringue remplie de tampon salin.
- Positionner la micropipette selon un angle précis par rapport à la boîte de culture.
- Appliquer une pression fluide pour induire des varicosités dans les neurones.
Résultats principaux
- Induction réussie de varicosités axonales chez les neurones hippocampiques de souris.
- L'imagerie fluorescente a confirmé la présence de varicosités.
- La méthode a démontré une reproductibilité dans les cultures neuronales.
- A permis d'obtenir des informations sur la stimulation mécanique des neurones.
Conclusions
- La méthode décrite est efficace pour l'étude des varicosités axonales.
- La manipulation par micropipette est un outil précieux dans la recherche en neurosciences.
- Des études supplémentaires peuvent explorer les implications fonctionnelles des varicosités induites.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Les modèles de varicosités axonales induites mécaniquement permettent aux équipes biopharmaceutiques d'analyser la réponse neuronale au stress physique, soutenant ainsi la validation précoce des cibles dans la recherche sur la neurodégénérescence et les lésions. L'induction et la visualisation quantitatives des varicosités offrent un système contrôlé pour évaluer la vulnérabilité et la résilience neuronales, renforçant la confiance prédictive dans les voies pertinentes pour la maladie. Cette approche renforce la détection mécanistique des risques au point critique de découverte des actifs du portefeuille du SNC.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet de tester directement la susceptibilité neuronale aux contraintes mécaniques liées aux troubles du système nerveux central.
- Permet une validation fonctionnelle des cibles en associant des stimuli physiques à une pathologie axonale.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en modélisant une lésion neuronale aiguë in vitro.
Développement de tests et criblage
- Offre un système reproductible pour induire et quantifier les varicosités axonales dans des neurones en culture.
- Standardise l'induction de phénotypes neuronaux en aval pour le criblage de composés.
- Permet des sorties d'imagerie quantitative pour le développement et l'optimisation des tests.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur des modèles pertinents pour la maladie en matière de lésion axonale et de neurodégénérescence.
- Permet une continuité entre les études mécanistiques in vitro et la validation préclinique de stratégies neuroprotectrices.
- Éclaire les décisions d'avancement tenant compte du risque pour les thérapeutiques ciblant le système nerveux central.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode d'induction micromécanique s'inscrit dans le continuum allant de la découverte précoce à l'identification de composés candidats pour la recherche sur le système nerveux central, en offrant une plateforme pour la vérification d'hypothèses et le criblage phénotypique.
- Biologie de la découverte : Permet l'interrogation fondée sur des hypothèses de la réponse axonale au stress mécanique.
- Écrantage : Assure une induction standardisée et reproductible de varicosités pour l'évaluation de composés.
- Analytique : Prend en charge l'imagerie quantitative et la mesure des phénotypes neuronaux.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les résultats in vitro et les modèles précliniques de pathologie axonale.
- Réutilisation en entreprise : Offre un flux de travail réutilisable pour diverses études en neurobiologie et neurotoxicologie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans les mécanismes de lésion neuronale et la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation des tests de stress neuronal.
- Valeur stratégique : Affine les décisions d'avancement ou d'abandon des actifs du SNC en clarifiant les risques mécanistiques.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque des candidats neuroprotecteurs et neurogénérateurs.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture neuronale, micromanipulation et imagerie de fluorescence.
- Suppose l'accès à des micromanipulateurs, des micropipettes et à une infrastructure d'imagerie.
- Exige une standardisation interéquipes des paramètres de stimulation et des protocoles d'imagerie.
- Adaptable à divers sous-types neuronaux et systèmes de culture moyennant une optimisation du protocole.
- Limité à la modélisation in vitro ; la pertinence translationnelle dépend de l'alignement avec les mécanismes de la maladie.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 22 août 2026