Une approche non invasive pour étudier l’électrophysiologie des motoneurones chez les embryons de poisson-zèbre

Placez des embryons de poisson-zèbre génétiquement modifiés sous un stéréomicroscope et observez l’enroulement spontané de la queue déclenché par les motoneurones de la moelle épinière.

Les propriétés intrinsèques de ces neurones provoquent un afflux d’ions à travers les canaux sodiques, conduisant à une dépolarisation membranaire spontanée et à la génération de potentiels d’action qui se propagent aux muscles, déclenchant l’enroulement de la queue. Mesurez la fréquence d’enroulement.

Transférez certains embryons dans un inhibiteur des canaux sodiques pour inhiber l’afflux de sodium et évaluer la fréquence réduite de l’enroulement.

Montez les embryons non traités dans de l’agarose fondue, laissez l’agarose se solidifier pour restreindre les mouvements et observez au microscope à fluorescence.

Les motoneurones expriment un biocapteur avec un domaine de détection de tension lié à la membrane, ou VSD, fusionné à des fluorophores donneurs et accepteurs.

La dépolarisation modifie la conformation du VSD, rapprochant les fluorophores.

Lors de l’excitation, le donneur transfère de l’énergie à l’accepteur, provoquant une émission de fluorescence de l’accepteur.

Ajoutez le bloqueur pour inhiber la dépolarisation, ce qui réduit l’émission de l’accepteur, confirmant l’inhibition médiée par le bloqueur de la dépolarisation spontanée dans les neurones.

Pour une analyse spontanée de l’enroulement de la queue, transférez les embryons dans une boîte de Pétri ronde de 90 millimètres remplie d’eau de poisson contenant 0,2 % de DMSO, et déchorionnez-les manuellement à l’aide de deux pinces de bijoutier à pointes pointues ou aiguilles. Ensuite, incubez les embryons pendant 5 minutes à 28 degrés Celsius. À l’aide d’un appareil photo numérique monté sur un stéréomicroscope, détectez l’enroulement de la queue à température ambiante lors d’un enregistrement vidéo d’une minute.

Ensuite, acquérez la série chronologique à une résolution temporelle de 30 images par seconde. Ensuite, calculez la fréquence d’enroulement spontané de la queue en comptant le nombre de courbures par unité de temps. Pour évaluer l’effet du médicament riluzole, transférez les embryons dans une nouvelle boîte de Pétri de 90 millimètres remplie d’eau de poisson contenant 5 micromolaires de riluzole. Ensuite, incubez les embryons pendant 5 minutes à 28 degrés Celsius avant d’enregistrer une vidéo d’une minute et d’effectuer l’analyse comportementale.

Maintenant, montez les embryons de 20 à 24 hpf dans de l’agarose à bas point de fusion à 1 % dans de l’eau de poisson à l’intérieur d’une boîte d’imagerie à fond de verre de 35 millimètres à 37 degrés Celsius. Orientez les embryons sur le côté et attendez que l’agarose se solidifie à température ambiante.

Ensuite, transférez la parabole d’imagerie sur la platine d’un microscope confocal. Identifiez les motoneurones exprimant le biocapteur en excitant le monomère Umikinoko-Green avec un laser argon de 488 nanomètres. Ensuite, réglez son émission entre 495 et 525 nanomètres et appuyez sur Enregistrer.

Pour une mesure FRET, excitez mUKG, le donneur de la paire FRET avec un laser de 488 nanomètres. Simultanément, à l’aide de deux photomultiplicateurs, détectez la fluorescence émise par le donneur et la fluorescence émise par l’accepteur monomère Kusabira-Orange. Au début de l’expérience, optimisez le gain et le décalage du photomultiplicateur 1, où la fluorescence mUKG est enregistrée, et maintenez-les constants tout au long de la session.

Pour définir le décalage, remplacez la couleur de l’image par les valeurs d’intensité à l’aide de la table de recherche Q. Lors de la numérisation avec un laser éteint, utilisez le curseur de décalage pour que les pixels d’arrière-plan aient une intensité légèrement supérieure à zéro. À l’aide de la même table de correspondance, allumez le laser. Pendant le balayage, utilisez le curseur de gain pour maximiser le rapport signal/bruit, en prenant soin d’éviter les pixels saturés.

Dans la fenêtre d’acquisition de logiciels, sélectionnez le mode d’acquisition xyt et une taille de champ d’image de 512 x 64 pixels dans le menu déroulant. Ensuite, réglez l’enregistrement des changements de tension des neurones spinaux embryonnaires pour acquérir un seul plan xy toutes les 30 millisecondes pendant une minute. Évaluez l’effet de l’administration de riluzole sur la dépolarisation membranaire dans le même neurone, acquérez un nouvel ensemble de données cinq minutes après l’ajout d’eau de poisson contenant 5 micromolaires de riluzole.