Surveillance des signaux électriques des neurones afférents chez une larve de poisson-zèbre immobilisée

Commencez avec une larve de poisson-zèbre immobilisée et paralysée dans une chambre d’enregistrement remplie d’une solution extracellulaire dans un dispositif d’électrophysiologie.

Remplissez une micropipette afférente avec la solution extracellulaire contenant des ions qui fournissent la conductivité électrique pour l’enregistrement de l’activité neuronale.

Assemblez-le dans un micromanipulateur contenant une électrode d’enregistrement reliée à un amplificateur pour l’enregistrement du signal.

Appliquez une pression d’air positive pour éviter que la pipette ne se bouche.

Déplacez la pointe de la pipette le long de la ligne nerveuse latérale et positionnez-la à côté du ganglion afférent qui contient un groupe de corps cellulaires neuronaux afférents.

Les processus cellulaires de ces neurones sont connectés aux cellules ciliées situées le long de la ligne latérale, qui détectent les mouvements de l’eau.

Ensuite, appliquez une légère pression négative pour former un joint lâche entre la micropipette et le ganglion afférent.

Enregistrez les signaux électriques des neurones afférents, qui reçoivent l’entrée sensorielle des cellules ciliées de la larve immobilisée.

Immobilisez les larves de poisson-zèbre et transférez-les dans une boîte de Pétri de 35 millimètres à l’aide d’une pipette de transfert à grande pointe. Retirez autant que possible la solution environnante. Immergez les larves dans 10 microlitres d’alpha bungarotoxine à 0,1 % pendant environ cinq minutes. Lavez la larve paralysée avec une solution extracellulaire pendant 10 minutes. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert, la larve passe du bain de solution extracellulaire à la boîte d’enregistrement à fond de silicone.

Sous un stéréomicroscope, positionnez doucement les larves à l’aide d’une pince à pointe fine au-dessus du centre du tapis de silicone, côté latéral vers le haut, les extrémités antérieure et postérieure du corps allant de gauche à droite. À l’aide d’une pince à pointe fine, insérez la goupille gravée orthogonalement au silicone à travers la notocorde dorsale des larves, directement dorsale à l’anus. Insérez la deuxième goupille dans la notocorde près de l’extrémité de la queue, et insérez la troisième goupille dans la dorsale de la notocorde de la vessie à gaz. Insérez la quatrième goupille à travers la vésicule otique tout en assurant une légère rotation lorsque la goupille s’insère dans l’encapsulant.

Lorsqu’une légère rotation est appliquée, surveillez le tissu entre le cleithrum et la vésicule otique pour révéler l’amas de somates afférentes. Placez la lave épinglée sous l’objectif 10 fois sur une platine fixe du microscope DIC, et orientez les fentes myoseptales des blocs musculaires parallèlement au vecteur de la scène de tête gauche.

Placez le fil de terre dans la solution du bain et assurez-vous qu’il est connecté à la tête gauche. Remplissez l’électrode d’enregistrement afférente avec 30 microlitres de solution extracellulaire et insérez-la dans le support de pipette de l’étage de tête droit. Ensuite, abaissez-le dans la solution de parabole tout en appliquant une pression positive produite par un transducteur pneumatique.

Localisez l’électrode et amenez la pointe de l’électrode sur l’échantillon. À l’aide d’un micromanipulateur, abaissez l’extrémité de l’électrode afférente jusqu’à ce qu’elle soit en position de maintien au-dessus du cléithrum. Augmentez le grossissement à 40 fois l’immersion et localisez l’intersection de la ligne latérale postérieure, du nerf et du cleithrum. Amenez la pointe de l’électrode sur le ganglion afférent et abaissez la pipette jusqu’à ce que la pointe entre en contact avec l’épithélium. Doucement, manœuvrez l’électrode de manière à ce que toute la circonférence de la pointe entre en contact avec le ganglion afférent.