Enregistrement optique de l’activité neuronale dans des tranches de cerveau colorées avec un colorant sensible au voltage
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 3:10 min • July 8th, 2025
Prenez une tranche de cerveau de souris immobilisée colorée avec un colorant sensible au voltage ou VSD, des molécules fluorescentes qui s’intègrent dans la membrane neuronale et réagissent aux changements de potentiel membranaire.
Placez la tranche dans une chambre d’enregistrement.
Installez l’électrode de terre pour une référence de tension de base.
Ensuite, positionnez les électrodes de stimulation et d’enregistrement sur la tranche.
Appliquez une impulsion électrique.
L’impulsion stimule les neurones, déclenchant l’ouverture des canaux sodiques voltage-dépendants et l’afflux d’ions sodium, entraînant une modification du potentiel membranaire.
Cela induit un potentiel d’action, mesuré par l’électrode enregistreuse, et modifie les propriétés fluorescentes du VSD.
Exposez la tranche de cerveau à une longueur d’onde spécifique pour exciter le VSD et déclencher l’émission de fluorescence.
Après la stimulation, les canaux sodiques se ferment tandis que les canaux potassiques voltage-dépendants s’ouvrent, favorisant l’efflux d’ions potassiques.
Cela modifie à nouveau le potentiel de la membrane et, par conséquent, modifie la fluorescence du VSD.
Enregistrez la fluorescence en temps réel pour représenter visuellement l’activité neuronale.
Pour commencer cette procédure, allumez l’amplificateur, l’ordinateur et la caméra, puis ouvrez le logiciel. Versez l’aCSF dans un tube de 50 millilitres et faites-le bouillir avec du carbogène. Utilisez une pompe péristaltique pour faire circuler l’aCSF et ajustez le débit à environ un millilitre par minute.
Ensuite, ajustez la hauteur de la pipette d’aspiration de manière à ce que le niveau de liquide à l’intérieur de la chambre d’expérience soit toujours constant. Placez l’électrode de terre dans la chambre. Ensuite, remplissez l’électrode en verre avec une petite quantité d’aCSF et placez-la dans le porte-électrode. Fixez le support à la tige du manipulateur.
À l’aide d’un amplificateur, assurez-vous que la résistance de l’électrode est d’environ 1 mégaohm. Au cours de la session d’enregistrement, transférez une tranche de la chambre humide vers une chambre expérimentale. Appuyez fermement le bord de l’anneau dans le joint torique en silicone. Veillez à ne pas casser la membrane ou le fond de la chambre d’expérience.
Sous le microscope, placez la pointe de l’électrode de stimulation et l’électrode d’enregistrement du potentiel de champ sur la tranche. Vérifiez la réponse évoquée en délivrant un stimulus. Vérifiez que le champ de vision couvre le circuit neuronal droit dans le système d’enregistrement optique.
Ensuite, ajustez l’intensité de la lumière d’excitation à environ 70 % à 80 % de la capacité maximale de la caméra. À l’aide de la source de lumière fluorescente, ajustez la mise au point avec le système d’acquisition. Ensuite, lancez l’enregistrement, et analysez les données dans un logiciel d’acquisition d’images après l’acquisition.
Aperçu
Cet article décrit une méthode d'enregistrement de l'activité neuronale à l'aide de colorants sensibles au voltage (VSD) sur des tranches de cerveau de souris immobilisées. La procédure consiste à stimuler les neurones et à mesurer les variations du potentiel membranaire par émission de fluorescence.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Électrophysiologie
- Techniques d'imagerie
Contexte
- Les colorants sensibles au voltage sont utilisés pour visualiser les variations du potentiel membranaire neuronal.
- La compréhension de l'activité neuronale est essentielle pour la recherche en neurosciences.
- Cette méthode permet l'observation en temps réel des potentiels d'action.
- Les variations de fluorescence sont corrélées à la décharge neuronale et peuvent être analysées de manière quantitative.
Objectif de l'étude
- Démontrer une technique de mesure de l'activité neuronale dans des tranches cérébrales.
- Fournir un protocole détaillé pour l'utilisation des sondes de voltage (VSD) dans les études électrophysiologiques.
- Approfondir la compréhension des mécanismes de signalisation neuronale.
Méthodes utilisées
- Préparation de tranches cérébrales immobilisées marquées avec un colorant sensible à la tension (VSD).
- Application d'impulsions électriques pour stimuler l'activité neuronale.
- Enregistrement en temps réel des variations de fluorescence afin d'évaluer les changements de potentiel membranaire.
- Utilisation de longueurs d'onde spécifiques pour exciter le VSD et capter les émissions de fluorescence.
Résultats principaux
- Mesure réussie des potentiels d'action par des variations de fluorescence.
- Mise en évidence de la relation entre l'activité des canaux sodiques et le potentiel membranaire.
- Visualisation en temps réel de l'activité neuronale en réponse à une stimulation.
- Validation de la méthode grâce à des résultats cohérents entre les essais.
Conclusions
- La technique du VSD est efficace pour l'étude de la dynamique neuronale.
- Cette méthode permet d'obtenir des informations sur les mécanismes de génération du potentiel d'action.
- Des applications futures pourraient inclure l'exploration de divers circuits neuronaux et de leurs fonctions.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'enregistrement optique de l'activité neuronale à l'aide de colorants sensibles aux potentiels permet la visualisation en temps réel de la dynamique du potentiel membranaire dans le tissu cérébral, soutenant ainsi la réduction des risques mécanistiques lors de la validation précoce des cibles en neurosciences. Cette approche fournit des lectures quantitatives basées sur la fluorescence, renforçant la fiabilité prédictive de la modulation des voies neuronales et de la pharmacologie à l'échelle des circuits. Elle constitue un pont translationnel entre l'électrophysiologie et l'imagerie pour réduire les risques liés à l'engagement des cibles en découverte de médicaments du système nerveux central.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en associant la stimulation électrique à des changements de fluorescence mesurables dans les membranes neuronales.
- Valeur opérationnelle : Facilite la clarification des voies grâce au suivi en temps réel de la propagation du potentiel d'action dans des circuits neuronaux définis.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans la cible en corrélant l'activité des canaux ioniques (par exemple, l'influx de sodium) avec des signaux optiques pour une détection mécanistique des risques.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés (tranches de cerveau) en vue de la standardisation d'essais en aval en utilisant la fluorescence comme variable dépendante quantitative.
- Valeur opérationnelle : Permet la reproductibilité des essais grâce à une stimulation contrôlée et une réponse cohérente de la fluorescence du colorant potentiel sensible (VSD) d'un essai à l'autre.
- Extensibilité : Facilite la réutilisation de la plateforme pour évaluer les effets de composés sur l'excitabilité neuronale dans un système préparé de manière standardisée.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Préserve l'intégrité d'un système pertinent pour la maladie en maintenant l'architecture neuronale native dans les tranches, permettant une corrélation avec des biomarqueurs translationnels.
- Valeur opérationnelle : Garantit une continuité entre la phase de découverte et la validation préclinique en fournissant un indicateur constant de l'activité neuronale.
- Maîtrise des risques : Appuie les décisions d'avancement ajustées au risque en offrant des résultats quantifiables et reproductibles liés aux variations du potentiel membranaire.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'intègre dans la continuité de la découverte, depuis le test d'hypothèses en phase précoce jusqu'à l'identification de composés actifs par des lectures fonctionnelles neuronales, et soutient les travaux précliniques grâce à une mesure cohérente de l'activité.
- Biologie de la découverte : Permet la visualisation des réponses neuronales à une stimulation électrique ou pharmacologique, facilitant ainsi la validation d'hypothèses.
- Essais de criblage : Offre une prête-à-l'emploi analytique grâce à l'enregistrement standardisé de la fluorescence et à des protocoles de stimulation reproductibles.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives de la fluorescence permettant de comparer les états d'activité neuronale dans différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en préservant la fonction au niveau des circuits dans des tissus ex vivo pour la validation de cibles.
- Réutilisation en milieu professionnel : Constitue une capacité réutilisable dans divers projets nécessitant des relevés en temps réel de l'activité neuronale dans des modèles de tranches cérébrales.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en réduisant l'ambiguïté mécanistique des voies de signalisation neuronale.
- Valeur opérationnelle : Renforce la standardisation et la reproductibilité grâce à des paramètres définis de stimulation, d'imagerie et de capture de la fluorescence.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en fournissant des données objectives et quantifiables sur l'engagement de la cible dans les circuits neuronaux.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque en reliant les variations de fluorescence à la réponse fonctionnelle neuronale pour une meilleure gestion des risques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en électrophysiologie, en microscopie à fluorescence et en analyse d'images pour une interprétation précise des données.
- Dépend d'instruments tels que des amplificateurs, des stimulateurs, des sources de lumière fluorescente et des systèmes de caméra capables d'acquisition à grande vitesse.
- Implique une standardisation inter-équipes des protocoles de marquage, des paramètres de stimulation et de la correction de la fluorescence de base.
- Suppose des adaptations selon les systèmes modèles (par exemple, espèce, région cérébrale, épaisseur de coupe) afin de préserver la fidélité du signal.
- Comprend des limites pratiques telles que la toxicité des colorants, le photoblanchiment et les contraintes de rapport signal/bruit dans les tissus épais ou fortement diffusants.
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Dernière mise à jour : 29 août 2026