Surveillance optique et électrophysiologique simultanée de cellules neuronales dans des coupes de cerveau

Commencez par perfuser un liquide céphalo-rachidien artificiel aéré ou un LCRa sur une grille de maille dans une chambre de perfusion.

Transférez une tranche de cerveau contenant des neurones exprimant des protéines fluorescentes et ancrez-la avec un appareil câblé en platine.

Faites pivoter la grille de maillage pour l’alignement.

Abaissez la sonde multicanaux vers la tranche.

Ajustez le cube de filtre pour la visualisation des protéines fluorescentes.

Tournez la tranche pour aligner la sonde.

Ajustez la hauteur de la sonde sous la surface du tissu.

Maintenant, perfuser l’aCSF et se concentrer sur les neurones marqués par fluorescence.

À l’aide d’un objectif haute puissance, concentrez-vous sur le tissu et ajustez la lumière d’excitation.

Utilisez un filtre de lumière approprié pour observer la fluorescence dans les neurones.

Ajustez la lentille de l’objectif pour créer de l’espace pour la pipette patch et appliquez une pression positive.

Ensuite, positionnez la pipette près du neurone pour former une fossette membranaire.

Enfin, appliquez une faible aspiration pour créer un joint de membrane, suivie d’une forte aspiration pour briser la membrane et obtenir des enregistrements électriques du neurone ciblé.

Pour placer la sonde multicanaux dans la lame de tissu cérébral ex vivo, perfuser de l’ACSF expérimental à bulles de trois à six millilitres par minute, puis transférer la tranche de cerveau contenant la zone d’intérêt sur la grille de maillage de la chambre de perfusion du microscope. Ancrez la tranche de cerveau avec une harpe en platine. Faites pivoter la grille de maille de sorte que la ligne de contacts de l’électrode à l’extrémité distale de la sonde multicanaux soit approximativement perpendiculaire à la surface PL.

Sous un éclairage à champ large et un contrôle précis du micromanipulateur, abaissez la sonde multicanaux vers la surface de la tranche. Engagez le cube filtrant approprié pour la visualisation de la protéine rapporteure fluorescente exprimée dans les terminaisons axonales des afférences corticales.

Si nécessaire, faites pivoter la tranche pour aligner plus précisément la sonde sur la surface PL. Positionnez la sonde juste au-dessus du plan de la tranche, à 200 micromètres de la position finale de la cible le long de l’axe des x, en laissant au moins un canal à l’extérieur de la zone de tissu enregistrée. Lentement, insérez la sonde dans la tranche le long de son axe longitudinal.

Pour minimiser les dommages aux tissus, n’avancez la sonde que dans la mesure où les pointes pointues sont à peine visibles sous la surface du tissu. Basculez la source expérimentale ACSF vers la solution de contrôle ensachée et identifiez la cellule marquée par fluorescence pour un enregistrement ciblé par patch-clamp. Limitez l’ouverture au plus petit diamètre et engagez l’objectif à immersion dans l’eau haute puissance, en prenant soin d’éviter tout contact entre la sonde multicanaux et l’objectif de l’objectif. Faites la mise au point sur le tissu.

Centrez la lumière sur une zone de tissu adjacente à la sonde multicanaux, mais ne la chevauchant pas. Engagez le jeu de filtres approprié pour permettre l’imagerie des cellules exprimant le marqueur fluorescent dépendant de Cre. Soulevez l’objectif pour créer suffisamment d’espace pour abaisser une pipette patch.

Chargez une pipette patch avec la solution interne et montée sur le porte-électrode. À l’aide d’une seringue d’un millilitre, appliquez une pression positive correspondant à environ 0,1 millilitre d’air. Abaissez la pipette patch dans la solution, en mettant la pointe au point sous guidage visuel, et obtenez l’enregistrement de la cellule entière à partir de la cellule ciblée.