Détermination d’un test d’effet de l’hormone de croissance sur les neurones de la kisspeptine à l’aide d’un patch clamp à cellules entières

Fixez une tranche hypothalamique de souris transgénique dans une chambre d’enregistrement imprégnée d’aCSF.

La tranche contient des neurones kisspeptine exprimant la protéine de fusion fluorescente, cruciaux pour la régulation du système reproducteur.

Assemblez une micropipette composée d’une électrode d’enregistrement dans une solution interne.

Localisez au microscope un neurone fluorescent de kisspeptine.

Appliquez une pression positive sur la pipette et faites-la avancer vers le neurone cible. Au contact, la pression crée une indentation sur la membrane neuronale.

Appliquez une brève pression négative, formant un joint à haute résistance entre la micropipette et la membrane.

Réglez la tension de maintien sur le potentiel de repos physiologique du neurone pour des mesures précises.

Appliquez de brèves impulsions de pression négative pour briser la membrane, établissant ainsi une configuration de cellules entières.

Confirmez la viabilité du neurone en surveillant les paramètres.

Introduisez un test d’hormone de croissance, déclenchant des voies de signalisation et induisant des changements dans le potentiel membranaire du neurone.

Mesurez les changements dans le potentiel membranaire pour déterminer l’effet inhibiteur de l’hormone de croissance sur l’activité neuronale.

Transférez une tranche de cerveau d’intérêt, une à la fois, dans la chambre d’enregistrement à l’aide d’une pipette de transfert en acrylique. Tenez la tranche avec une ancre de tranche afin qu’elle ne bouge pas pendant la perfusion de l’aCSF. Positionnez la tranche au centre de la chambre d’enregistrement à l’aide de l’objectif basse consommation du microscope à immersion 10x ou 20x.

La position de la coupe est essentielle pour permettre une bonne vision de la région souhaitée au microscope et pour une portée parfaite de la micropipette enregistreuse. Après avoir localisé la région d’intérêt, passez la lentille de l’objectif à la lentille haute puissance, 63x, et concentrez-vous sur le niveau tissulaire, en observant la protéine fluorescente endogène et les formes des cellules de la région cible pour localiser les cellules kisspeptine à la surface de la tranche de cerveau.

Lorsqu’une cellule cible possible est localisée, marquez-la sur l’écran de l’ordinateur avec le curseur de la souris ou en dessinant un format comme un carré sur la zone d’intérêt. L’écran de l’ordinateur marqué permet de guider la position de la micropipette enregistreuse vers la cellule. Après avoir déterminé l’emplacement exact de la cellule cible, soulevez l’objectif et introduisez la micropipette enregistreuse remplie de la solution interne dans le porte-électrode, en vous assurant que la solution interne est en contact avec l’électrode d’argent.

Appliquez une pression positive avant d’immerger la micropipette dans la solution d’aCSF à l’aide d’une seringue remplie d’air de 1 à 3 millilitres reliée au support de la micropipette par un tube en polyéthylène pour empêcher les débris de pénétrer dans la micropipette. À l’aide du micro-manipulateur, guidez la micropipette sous le centre de l’objectif. Déplacez les boutons du micro-manipulateur pour guider les axes x, y, z de la micropipette vers la cellule d’intérêt.

Ajustez la mise au point pour voir la pointe de la micropipette et rapprochez-la de la mise au point, mais pas trop près de la tranche. Réduisez la vitesse du micromanipulateur et abaissez lentement la micropipette dans le plan de mise au point, en veillant à ce que la pointe de la micropipette ne pénètre pas brusquement dans la tranche, mais descende lentement jusqu’à ce qu’elle touche la surface de la cellule ou la région cible.

En appliquant une légère pression positive avec la seringue remplie d’air de 1 à 3 millilitres pour éliminer tous les débris de la trajectoire d’approche, déplacez lentement le micromanipulateur sur l’axe x, y, z pour rapprocher la pointe de la micropipette et toucher la cellule cible, ce qui provoque une fossette par la pression appliquée. Après avoir établi la fossette, à l’aide du mode de pince de tension sur le logiciel, appliquez une faible aspiration brève par la bouche pendant 1 à 2 secondes à travers le tube connecté au support de micropipette pour générer l’étanchéité entre la micropipette et la cellule.

Si le joint reste mécaniquement stable sans interférence sonore pendant environ une minute, réglez la tension de maintien au potentiel de repos physiologique le plus proche de la cellule d’intérêt. Pour les neurones hypothalamiques de kisspeptine, moins 50 millivolts sont recommandés. Ensuite, appliquez une brève aspiration par la bouche pour briser la membrane plasmique au niveau de l’extrémité de la micropipette scellée placée sur la cellule afin que la membrane rompue n’obstrue pas la micropipette, ou n’attire pas une partie importante de la membrane, ou la cellule.

Une configuration adéquate de l’ensemble des cellules peut être obtenue en effectuant une aspiration avec une force suffisante. Vérifiez le manuel des paramètres système utilisé. Après avoir brisé la membrane de la cellule, activez l’option Cellule entière en mode pince de tension et cliquez sur la commande automatique faisant référence à l’onglet Cellule entière.

Ensuite, vérifiez les paramètres de viabilité des cellules dans le logiciel comme décrit dans le manuscrit de texte. Surveiller la résistance de la série et la capacité en régime permanent des cellules pendant les expériences. Une fois que la configuration de l’ensemble de la cellule est correctement réalisée, mesurez les courants synaptiques en mode pince de tension. Enregistrez les variations du potentiel de la membrane de repos et les variations induites du potentiel de la membrane de repos dans le mode de pince de courant.