Installation de fenêtres optiques dans le cerveau de souris transgéniques pour imager les activités neuronales
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 4:49 min • July 8th, 2025
Commencez avec une souris anesthésiée, génétiquement modifiée, avec la tête fixée dans un adaptateur de maintien de la tête.
Le cerveau de la souris exprime une protéine fluorescente qui permet de détecter les activités neuronales.
Rasez et stérilisez séquentiellement le cuir chevelu avant de l’ouvrir.
Retirez le tissu conjonctif pour exposer le crâne.
Marquez les zones cibles et appliquez une couche de colle.
Utilisez une micro-perceuse pour amincir le crâne sur la zone marquée.
Retirez le morceau du crâne pour exposer le cerveau.
Appliquez du liquide céphalo-rachidien artificiel pour garder le cerveau humide.
Installez une fenêtre optique dans la zone et scellez-la avec de la colle, qui fournit une base pour la fixation du ciment.
Appliquez du ciment dentaire noir pour bloquer la lumière.
Répétez la procédure de l’autre côté du crâne.
Laissez l’animal se rétablir.
Pour imager l’activité neuronale, placez la souris anesthésiée sécurisée sous le microscope et acquérez des images.
Confirmez l’absence de réponse au pincement des orteils sur une souris anesthésiée de 20 à 25 grammes, de 1 an et demi à 2 mois et d’un mois et appliquez une pommade sur les yeux de l’animal. Placez la souris sur un coussin chauffant recouvert d’un rideau stérile et utilisez un adaptateur de maintien de la tête pour souris afin de stabiliser la tête. Rasez la majeure partie du cuir chevelu avec un rasoir à double tranchant et nettoyez la peau exposée avec des tampons de préparation d’alcool stériles séquentiels et des gommages à la solution de povidone iodée. Ensuite, à l’aide d’une paire de ciseaux, faites une coupe rectangulaire de 2 x 3 millimètres dans le cuir chevelu.
À l’aide d’un coton-tige, écartez la peau pour créer une zone d’exposition de plus de 3 millimètres de diamètre, et utilisez une lame microchirurgicale émoussée pour retirer doucement le tissu conjonctif attaché au crâne. À l’aide d’une perceuse dentaire, tracez doucement un cercle de 3 millimètres de diamètre autour de la zone S1. Après avoir fait un cercle similaire sur le côté gauche du crâne, appliquez une fine couche de superglue cyanoacrylate sur les deux côtés de l’os pour fournir une base pour l’application de ciment dentaire.
Sous un microscope à dissection, utilisez une micro-perceuse à grande vitesse pour amincir une rainure circulaire sur le côté droit du crâne autour de la zone S1 afin de créer un bord lisse, en aspirant les débris osseux avec un aspirateur si nécessaire. Une fois qu’une profondeur osseuse d’environ 2/3 a été atteinte, amincissez lentement et soigneusement le tiers restant de l’os jusqu’à ce qu’un lambeau osseux circulaire ait été complètement libéré du crâne environnant. Utilisez une paire de pinces # 5/45 pour retirer lentement et soigneusement le morceau d’os circulaire afin d’exposer la dure-mère, en prenant soin de ne pas endommager les vaisseaux piaux.
Après avoir retiré un lambeau osseux du côté gauche du crâne de la même manière, rincez la fenêtre optique du côté droit du crâne avec une solution saline stérile et vérifiez les imperfections au stéréomicroscope. Installez la fenêtre optique sur la région de la craniotomie, la partie supérieure de la fenêtre reposant sur le crâne et la partie inférieure à l’intérieur de l’ouverture craniotomisée, reposant sur la dure-mère en présence de liquide céphalo-rachidien. Utilisez la super colle cyanoacrylate pour sceller la partie supérieure du bord de la fenêtre optique au crâne.
Lorsque la colle a séché, appliquez du ciment dentaire noir sur le bord du verre, le reste du côté droit du crâne exposé et les bords de la plaie pour bloquer la lumière. Ensuite, installez la fenêtre optique gauche et laissez l’animal se rétablir avec surveillance jusqu’à ce qu’il soit complètement couché. 7 à 10 jours après l’intervention, placez l’animal anesthésié dans l’adaptateur de maintien de la tête sur un coussin chauffant, sous un microscope à deux photons, en prenant soin que la fenêtre optique et le côté droit du crâne soient orientés perpendiculairement à l’axe optique du microscope.
Acquérir une première image cartographique de référence de la fenêtre crânienne à l’aide d’un éclairage en fond clair à un grossissement de 4 fois. Après avoir acquis plusieurs images de la même région d’intérêt, imagez la dynamique calcique dans la zone S1 de l’hémisphère gauche et calculez les changements de fluorescence de chaque région d’intérêt des deux côtés du crâne.
Aperçu
Cet article décrit un protocole détaillé pour l'imagerie de l'activité neuronale chez des souris génétiquement modifiées à l'aide d'un microscope à deux photons. La procédure consiste à créer une fenêtre crânienne afin de permettre l'observation directe de l'activité cérébrale tout en assurant la sécurité et le confort de l'animal.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Techniques d'imagerie
- Modèles animaux
Contexte
- Comprendre l'activité neuronale est essentiel pour la recherche en neurosciences.
- Les souris génétiquement modifiées permettent d'obtenir des informations sur des mécanismes neuronaux spécifiques.
- La microscopie à deux photons permet une imagerie de haute résolution de l'activité cérébrale.
- Des techniques chirurgicales appropriées sont essentielles pour une imagerie réussie.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour l'imagerie de l'activité neuronale chez des souris vivantes.
- Approfondir la compréhension du fonctionnement cérébral par observation directe.
- Fournir un protocole détaillé aux chercheurs du domaine.
Méthodes utilisées
- Préparation de la souris, y compris l'anesthésie et la stabilisation de la tête.
- Réalisation chirurgicale d'une fenêtre crânienne pour l'imagerie.
- Application de liquide céphalorachidien artificiel pour maintenir la santé du cerveau.
- Utilisation de la microscopie à deux photons pour acquérir des images de l'activité neuronale.
Résultats principaux
- Imagerie réussie des dynamiques calciques dans la région S1 du cerveau.
- Démonstration de la faisabilité de la technique de fenêtre crânienne.
- Mise à disposition d'une carte de référence pour les études d'imagerie futures.
- Confirmation de l'efficacité de la méthode chez des souris anesthésiées.
Conclusions
- La technique de la fenêtre crânienne est un outil précieux pour la recherche en neurosciences.
- Cette méthode permet l'observation en temps réel de l'activité neuronale.
- De futures études pourront s'appuyer sur ce protocole pour explorer divers mécanismes neuronaux.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'établissement d'une imagerie fiable de l'activité neuronale chez des modèles transgéniques soutient la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques dans la découverte de médicaments pour le système nerveux central. La technique de fenêtre crânienne permet une surveillance longitudinale et quantitative des dynamiques neuronales, améliorant ainsi la fiabilité prédictive des hypothèses thérapeutiques en phase précoce. Cette approche réduit l'incertitude biologique en fournissant des lectures directes et transposables de l'engagement de la cible et de la modulation des voies dans des systèmes pertinents pour la maladie.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation des cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à l'observation en temps réel de l'activité neuronale dans des circuits génétiquement définis.
- Valeur opérationnelle : Fournit une plateforme reproductible pour la validation fonctionnelle de cibles en utilisant le flux calcique comme indicateur mécanistique.
- Valeur stratégique : Renforce la confiance prédictive et permet le tri du portefeuille en reliant la modulation de la cible à des changements phénotypiques mesurables dans les réseaux neuronaux.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour le criblage de composés en stabilisant les lectures d'activité neuronale dans le temps.
- Valeur opérationnelle : Normalise les conditions d'imagerie grâce à la stabilisation du crâne et à un ciment bloquant la lumière, améliorant ainsi la reproductibilité des tests.
- Valeur stratégique : Permet une évaluation fiable des composés en réduisant les variabilités environnementales et procédurales dans les études longitudinales.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : S'aligne sur des systèmes pertinents pour la maladie en permettant l'imagerie chez des souris Thy1-GCaMP6s, un modèle d'excitabilité neuronale et de fonctionnement des réseaux.
- Valeur opérationnelle : Garantit la continuité du stade de découverte à la validation préclinique grâce à la stabilité de la fenêtre chronique et à des séances d'imagerie répétées.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'avancement ajustées au risque en fournissant des données quantitatives et longitudinales sur l'engagement de la cible et les effets à l'échelle des circuits.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, depuis la validation précoce de la cible jusqu'à l'identification du composé candidat et aux tests d'efficacité préclinique, grâce à sa capacité à effectuer des mesures répétées et quantitatives de l'activité neuronale.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en permettant l'observation directe des dynamiques calciques en réponse à des perturbations pharmacologiques ou génétiques.
- Criblage : Offre une prête-à-l'emploi pour les tests et des résultats quantitatifs grâce à des niveaux de fluorescence stabilisés et au suivi de régions d'intérêt à travers les hémisphères.
- Analyse : Produit des résultats statistiques tels que le calcul des variations de fluorescence, permettant des comparaisons entre groupes et la détermination de l'ampleur des effets.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique grâce à la possibilité d'imagerie longitudinale et à l'alignement de biomarqueurs avec les profils d'activité neuronale.
- Réutilisation institutionnelle : Fonctionne comme une plateforme réutilisable pour plusieurs bras d'étude, réduisant la charge liée à la mise en place de chaque expérience et améliorant la cohérence entre projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive, validation des cibles, réduction de l'ambiguïté mécanistique dans les voies du SNC.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité entre laboratoires et au fil du temps.
- Valeur stratégique : Meilleures décisions d'aller/arrêt, efficacité du capital et réduction des risques biologiques en phase avancée dans les neurothérapeutiques.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation et décisions d'avancement ajustées au risque, basées sur des profils d'activité neuronale longitudinaux.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microchirurgie, en gestion de l'anesthésie et en manipulation d'animaux transgéniques.
- Dépend d'instruments de précision tels que des microforets, des pinces, des stéréomicroscopes et des systèmes d'imagerie à deux photons.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles chirurgicaux, des soins postopératoires et des paramètres d'imagerie.
- Implique des adaptations selon les souches, l'âge et le fond génétique des souris afin de préserver l'intégrité de la fenêtre et la qualité du signal.
- Les limites pratiques incluent la dépendance vis-à-vis du niveau de compétence chirurgicale, les risques d'inflammation postopératoire, ainsi que la nécessité d'un soutien vétérinaire et technique spécialisé.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 29 août 2026