JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 3:45 min • July 8th, 2025
Placez une tranche de moelle épinière de rat dans une chambre d’enregistrement et fixez-la avec un ancrage de tissu.
Perfuser la tranche avec du liquide céphalo-rachidien artificiel.
Au microscope, identifiez la substance gélatinosa translucide ou la région SG et sélectionnez un neurone SG sain.
Placez une pipette patch remplie d’une solution ionique près du neurone.
Appliquez une légère pression positive pour enlever tous les débris de la pointe de la pipette.
Déplacez la pipette vers le neurone.
Ensuite, relâchez la pression positive pour former une fossette sur la membrane neuronale, créant ainsi un joint.
Modifiez le potentiel de rétention pour le rapprocher du potentiel de membrane au repos, ou RMP.
Utilisez une brève aspiration pour rompre la membrane, établissant une configuration de cellules entières.
À RMP, appliquez des impulsions électriques dépolarisantes.
Ces impulsions ouvrent des canaux sodiques voltage-dépendants, permettant un afflux rapide d’ions sodium.
Cet afflux d’ions déclenche un potentiel d’action, entraînant l’activation des neurones.
Enregistrez les modèles de décharge des neurones.
Pour effectuer des enregistrements patch-clamp de cellules entières à partir de neurones substantia gelatinosa ou SG, utilisez des solutions intracellulaires à base d’ions potassium pour l’enregistrement, tout en appliquant une solution à base de cations césium uniquement pour l’enregistrement des courants postsynaptiques inhibiteurs.
Déplacez doucement la tranche de moelle épinière vers la chambre d’enregistrement, puis stabilisez-la fermement avec un fil de platine en forme de U avec des fils de nylon, pour une stabilité optimale de la tranche. Perfuser régulièrement la tranche avec de l’ACSF à bulles à température ambiante et régler le taux de perfusion à 2 à 4 millilitres par minute pour obtenir une oxygénation suffisante.
Ensuite, à l’aide d’une lentille de microscope à basse résolution, identifiez la région des neurones SG comme une bande translucide. Choisissez un neurone sain, caractérisé par une forme tridimensionnelle avec une membrane brillante et lisse, comme cellule cible, à l’aide de l’objectif haute résolution, et ajustez-le au centre de l’écran du moniteur vidéo.
Remplissez une micropipette avec un volume approprié de solution intracellulaire à base d’ions potassium ou de césium. Ensuite, insérez la micropipette dans le porte-électrode et assurez-vous que la solution intracellulaire est en contact avec le fil d’argent à l’intérieur du support. Faites la mise au point sur la micropipette et utilisez le micromanipulateur pour l’immerger dans l’ACSF. Appliquez une légère pression positive pour éloigner la saleté et les débris.
Déplacez progressivement la micropipette vers le neurone ciblé. Une fois que la pipette s’approche du neurone et qu’une très petite fossette se forme sur la membrane neuronale, relâchez la pression positive pour former un gigaseal. Modifier le potentiel de maintien à moins 70 millivolts, ce qui est proche du potentiel membranaire physiologique de repos d’une cellule.
Ensuite, appliquez une aspiration transitoire et douce sur la micropipette pour rompre la membrane et créer une bonne configuration de cellules entières. Enregistrez les propriétés de décharge en testant le modèle de décharge de chaque neurone dans la pince de courant avec une série d’impulsions de courant dépolarisant d’une seconde de 25 à 150 picoampères avec des incréments de 25 picoampères au potentiel de membrane au repos.