Enregistrement combiné de la production afférente stimulée mécaniquement et du marquage des terminaisons nerveuses dans les follicules pileux de souris

Commencez par une oreille externe de souris disséquée, ou oreille externe, avec ses nerfs connectés exposés.

Insérez le nerf destiné à l’enregistrement dans l’électrode d’enregistrement.

Retirez la couche de graisse près de la marge du pavillon pour exposer la base du follicule pileux, puis pliez la peau pour exposer les poils pour la stimulation.

Positionnez une sonde de stimulation mécanique pour toucher et dévier les poils.

Cette stimulation active les terminaisons nerveuses sensorielles, ouvre des canaux ioniques mécaniques, permet l’afflux d’ions positifs et génère des potentiels d’action.

Les potentiels d’action se propagent à travers ces terminaisons jusqu’au nerf enregistré. Visualisez le signal.

Ensuite, ajoutez un colorant fluorescent et poursuivez la stimulation des cheveux.

Le colorant se lie aux membranes neuronales stimulées et est internalisé par endocytose sans affecter l’activité neuronale.

Après la stimulation, laver pour enlever le colorant non lié.

Ajoutez un agent séquestrant pour éliminer le colorant non internalisé lié à la membrane.

À l’aide de la microscopie à fluorescence, visualisez la coloration dans les follicules pileux pour identifier les terminaisons nerveuses stimulées mécaniquement.

Pour effectuer des enregistrements contrôlés des potentiels d’action évoqués par le stimulus, utilisez une sonde mécanique en verre borosilicate de 10 centimètres poli au feu fixée à un actionneur piézoélectrique en céramique. Positionnez la sonde de manière à ce qu’elle se déplace parallèlement au pli cutané et touche les poils, pas la peau. Placez-le à environ un demi-millimètre à un millimètre au-dessus de la surface de la peau. Ensuite, vérifiez manuellement la stimulation en écoutant la sortie audio lorsque la sonde se déplace.

Maintenant, configurez le logiciel pour qu’il entraîne la stimulation mécanique d’une petite zone de poils. Par exemple, programmez des stimulations de trois secondes à cinq sinusoïdes Hertz toutes les 10 s. Cela nécessite un déplacement de la sonde entre 200 et 2000 microns. Ensuite, procédez à l’utilisation d’une stimulation automatisée répétée pour vérifier la cohérence des réponses enregistrées dans les nerfs. Des résultats reproductibles doivent être réalisables.

Lorsque les résultats sont cohérents, réduisez le taux de répétition à toutes les 30 secondes. De plus amples instructions sont fournies dans le protocole textuel. Pour étudier les propriétés des canaux mécanosensoriels et marquer les terminaisons mécanosensorielles autour des follicules pileux, ajoutez 10 micromolaires FM143 à la solution et laissez agir 60 minutes, tout en continuant à stimuler les cheveux avec la sonde oscillante.

Ce colorant bloque les canaux de transducteur candidats dans les neurones sensoriels en culture et dans les cellules ciliées de la cochlée. Cependant, il ne bloque pas le déclenchement in situ dans les afférences des follicules pileux matures. L’étiquetage des extrémités montre que le colorant agit comme les terminaisons, qui continuent de répondre à la stimulation mécanique tout au long de l’exposition au colorant.