L'utilisation d'un piège optique pour l'étude des interactions hôtes pathogènes pour l'imagerie cellulaire dynamique en direct

L’objectif général de l’expérience suivante est d’utiliser le piégeage optique combiné à la microscopie confocale à disque rotatif pour observer les interactions hôte-pathogène en temps réel. Pour ce faire, on ajoute d’abord les agents pathogènes d’intérêt dans un verre de protection chambré. Ensuite, une particule est sélectionnée et capturée à l’aide du piège optique.

Enfin, la particule est dirigée vers la cellule d’intérêt. Comme on le voit ici. Le piégeage optique peut être une méthode efficace pour contrôler deux particules pour l’observation des interactions intracellulaires dynamiques.

Cette méthode peut répondre à des questions importantes sur les interactions hôte-pathogène dans les domaines des maladies infectieuses et de l’immunologie, y compris quel est l’effet de sur la phagocytose lorsque le contrôle complet des relations spatiales entre les cellules hôtes et les agents pathogènes est obtenu, ainsi que si l’ordre des agents pathogènes absorbés par une cellule phagocytaire affecte la maturation phagocytaire. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car les conditions de piégeage doivent être optimisées pour différents types de cellules et de billes. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle comme le processus de configuration et d’intégration d’un disque rotatif.

Le confocal à un piège optique est difficile à conceptualiser en raison de l’alignement précis nécessaire pour tous les composants optiques. Récoltez l’agent pathogène d’intérêt. Par exemple, ici, 300 microlitres de Canada albicans cultivés pendant la nuit dans un bouillon sont retirés de la culture et transférés les agents pathogènes dans un tube de réaction de 1,5 millilitre.

Ensuite, lavez les agents pathogènes trois fois à environ 1300 G pendant cinq minutes à température ambiante, en aspirant le surnageant et en laissant la pastille intacte à chaque fois que le PBS et le sonicate sont remis en suspension. Après le troisième lavage, mettez en suspension le granulé dans 500 microlitres de PBS. Ensuite, dissolvez un milligramme du colorant dans 100 microlitres de diméthylformamide pour une concentration finale de 10 milligrammes par millilitre.

Ajoutez ensuite trois microlitres du mélange de colorant dans le tube de réaction contenant les agents pathogènes lavés. Placez une feuille autour des tubes car les colorants sont sensibles à la lumière et secouez l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant une heure, puis granulez et lavez l’échantillon en PB S3 fois comme auparavant. Remettre en suspension le granulé dans 300 microlitres de PBS après le dernier lavage.

Essai de média chaud et PVS à 37 degrés Celsius dans un bain d’eau Laver. Une plaque de culture tissulaire de 10 centimètres recouverte de macrophages bruts 2, 6, 4, 0,7 deux fois, avec du PBS, en aspirant le PBS entre chaque lavage. Ensuite, couvrez la surface de la plaque avec cinq millilitres de trypsine et incubez la plaque pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, frappez doucement le côté de la plaque pour détacher les cellules de la surface de la plaque. Attention à ne pas éclabousser la trypsine à l’extérieur de la plaque. Ajoutez maintenant cinq millilitres de fluide dans la plaque et transférez le mélange dans un tube de réaction.

Après la granulation, les cellules aspirent le média en prenant soin de ne pas perturber la pastille et remettent en suspension la pastille dans 10 millilitres de média. Ajoutez 400 microlitres de média dans chaque chambre d’une lame de chambre, puis ajoutez cinq microlitres de suspension cellulaire dans chaque chambre. Laissez les cellules se développer pendant la nuit dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2.

Récupérez la lame de la chambre de l’incubateur, pipette de cinq à 10 microlitres des agents pathogènes d’intérêt préalablement préparés et marqués par fluorescence dans chaque chambre de macrophages. Mélangez soigneusement les macrophages et les agents pathogènes en pipetant de haut en bas, en faisant attention de ne pas toucher le fond de la chambre et de ne pas déranger les macrophages collés. Allumez tous les composants du microscope confocal à disque rotatif.

Préparez le microscope en ajoutant de l’huile dans l’objectif à immersion dans l’huile. Insérez la lame de chambre dans la platine spécialisée, puis retirez le haut du microscope d’alignement de lame de chambre pour l’imagerie DIC. Allumez l’obturateur du piège optique et du laser IR.

Ouvrez ensuite l’obturateur du laser sur le piège optique. Vérifiez que l’obturateur situé devant le laser IR est fermé en vérifiant à l’aide de la carte IR. Concentrez-vous maintenant sur les macrophages sur la lame collée.

Ensuite, trouvez les agents pathogènes flottant librement dans la solution adjacente aux macrophages. La partie la plus difficile de cette procédure est de trouver le bon objet à suivre dans la chambre d’échantillonnage en raison des forces d’adhérence entre l’objet et le verre de couverture dans la chambre d’échantillonnage. Pour déplacer cet objet, vous devez déplacer la platine pendant que l’objet est tenu par le laser de circulation, et il est également important de noter que vous devez déplacer la platine à un loc suffisamment lent pour que la force de traînée de la platine ne dépasse pas la force de piégeage maximale par le piège.

Déplacez la platine de manière à ce que l’agent pathogène se trouve à proximité du piège. Ouvrez ensuite l’obturateur et engagez le piège. Déplacez l’échantillon pour mettre les macrophages en contact avec une image d’agent pathogène piégé stationnaire.

Les agents pathogènes équipés d’un microscope confocal à disque rotatif, soit en fluorescence DIC, soit d’une combinaison des deux populations distinctes de Canada albicans, qui mesurent généralement environ cinq microns, ont été étiquetés en vert, bleu et rouge. Pour illustrer l’imagerie, un seul C albicans a été piégé et déplacé en carré à travers un groupe d’autres levures, comme l’indiquent les flèches grises, démontrant ainsi sa capacité à capturer et à manipuler l’emplacement spécifique d’un seul agent pathogène choisi par l’opérateur, même dans un environnement surpeuplé. Pour illustrer davantage la flexibilité de ce système à piéger les différentes morphologies de forme présentées par les organismes pathogènes dans cette figure, la pince optique a été utilisée pour maintenir et situer une particule de C albicans avec une pseudo hyphy.

Le C albicans est marqué avec un colorant rouge et déplacé le long d’une trajectoire indiquée par la flèche blanche et placé à côté de cellules brutes fluorescentes GFPL C3. En vert. La partie levure des albicans a été piégée alors que la pseudo hyphy traînait.

La déesse Aspergillus fum a également été positionnée à côté d’une cellule de macrophage de souris brute afin d’analyser le temps absolu de phagocytose avec cette lignée cellulaire et cet agent pathogène particuliers. Dans cette figure, des images en champ clair montrent comment l’aspergillus piégé, comme indiqué par la flèche blanche, a été déplacé et positionné le long de la trajectoire indiquée par la flèche rouge. L’agent pathogène piégé est légèrement hors foyer en raison du piège qui pousse l’organisme légèrement au-dessus du plan focal.

Aspergillus a été déplacé jusqu’à ce qu’il soit placé à côté de la cellule brute souhaitée. Une fois que l’agent pathogène est entré en contact avec la cellule, le piège a été fermé. Le processus de phagocytose a été activé et l’imagerie en accéléré a été utilisée pour observer les événements cellulaires ultérieurs.

Au bout de 30 secondes, la membrane de la cellule brute a commencé à changer et à former une coupe autour de la particule. Au bout de 60 secondes, la coupe était complètement formée. De 90 secondes à 150 secondes, l’Afu Gotti devenait et engloutissait la particule, et en 180 secondes, la particule était complètement intériorisée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer un appareil de piège optique à disque rotatif et comment un tel instrument peut permettre de contrôler de manière non invasive les agents pathogènes pour l’imagerie de cellules vivantes après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des interactions hôte-pathogène pour étudier le rôle des relations spatiales entre les cellules hôtes et les agents pathogènes, et son rôle sur la réponse immunitaire qui en découle.