Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 3:34 min • July 8th, 2025
Prenez une tranche coronale de l’organe voméronasal chimiosensoriel d’une souris transgénique exprimant des neurones sensoriels marqués par fluorescence.
L’épithélium sensoriel contient ces neurones marqués, qui sont exposés à la lumière reliée à la cavité nasale pour détecter les signaux chimiques.
Fixez la tranche dans une chambre d’imagerie à l’aide d’un ancrage de tranche.
Transférez la chambre dans une configuration d’enregistrement et écoulez une solution extracellulaire oxygénée pour maintenir la viabilité des tissus.
Placez une pipette de perfusion près de la tranche pour introduire des stimuli chimiques et une pipette d’enregistrement sur les neurones sensoriels.
À l’aide d’un microscope à fluorescence, identifiez les neurones marqués.
Appliquez une pression positive pour éviter le colmatage de la pipette et approchez-vous d’un neurone jusqu’à ce qu’une fossette se forme sur la membrane.
Passez en pression négative, en aspirant la membrane dans la pipette.
Appliquer une aspiration pour rompre la membrane et établir une continuité avec le cytoplasme, appelée patch clamp à cellules entières, permettant l’introduction de stimuli chimiques et l’enregistrement des signaux électrophysiologiques résultants.
Transférez une tranche VNO dans la chambre d’imagerie et fixez la position de la tranche à l’aide d’un ancrage en acier inoxydable câblé avec des fibres synthétiques de 0,1 millimètre d’épaisseur. Ne couvrez pas la tranche de tissu avec l’un des fils de fibres synthétiques. Ensuite, transférez la chambre d’imagerie dans la configuration d’enregistrement et superfusionnez continuellement la tranche avec du S2 oxygéné à température ambiante.
Ajustez le capillaire d’aspiration à la surface de la solution pour créer un échange constant de solution de bain. Ensuite, ajustez le crayon de perfusion multi-barils 8 en 1 au-dessus et près de la partie non sensorielle de la tranche VNO qui contient le vaisseau sanguin. Ensuite, connectez l’électrode de référence et la solution de bain à l’aide du pont gélosé en forme de L rempli de chlorure de potassium de 150 millimolaires.
Ensuite, remplissez la pipette patch avec la solution de pipette S4. Montez la pipette sur l’électrode recouverte de chlorure d’argent reliée à l’étage de tête sans gratter le revêtement, et fixez-la fermement. Ensuite, appliquez une légère pression positive sur la pipette patch avant d’entrer dans le bain. Surveillez la pipette et assurez-vous qu’elle est comprise entre quatre mégaohms et 10 mégaohms.
Visualisez la coupe VNO avec une caméra CCD à l’aide d’une CID optimisée pour l’infrarouge, et identifiez les cellules exprimant FPR-rs3-i-Venus, ou les neurones marqués de manière similaire à l’aide d’un éclairage de fluorescence et d’un cube de filtre approprié. Approchez le corps cellulaire à l’aide de volants pour une sensibilité maximale. En raison de la pression positive, une petite bosse sur la membrane cellulaire du soma devient visible, une fois que la pointe de la pipette est à proximité.
Ensuite, relâchez la pression positive et appliquez une légère pression négative pour aspirer la membrane cellulaire, afin d’obtenir une étanchéité à haute résistance de 1 à 20 giga-ohms. Par la suite, appliquez une aspiration courte et douce pour perturber la membrane cellulaire et établir la configuration de l’ensemble de la cellule.