Mesure simultanée du calcium intracellulaire et du potentiel membranaire dans l’endothélium cérébral d’une souris

Prenez des segments de l’artère cérébrale postérieure d’une souris.

Incuber avec une solution enzymatique pour dégrader la matrice tissulaire, en relâchant les cellules.

Remplacez la solution par un tampon, puis transférez un segment dans une chambre d’enregistrement.

Dissocier mécaniquement les couches de tissu conjonctif et de cellules musculaires lisses, isolant le tube endothélial sous-jacent.

Fixez le tube, retirez les couches dissociées et ajoutez un tampon physiologique.

Placez la chambre dans un système d’enregistrement avec un flux tampon continu.

Introduisez un indicateur de calcium fluorescent qui pénètre dans les cellules endothéliales, puis insérez une électrode d’enregistrement dans une cellule.

Administrer un médicament qui déclenche l’afflux d’ions calcium et induit une signalisation en aval pour la libération de calcium à partir du réticulum endoplasmique.

L’indicateur se lie au calcium et, lors de l’excitation, émet une fluorescence.

L’augmentation du calcium active les canaux potassiques dépendants du calcium, provoquant un écoulement de potassium et modifiant le potentiel membranaire.

Enregistrez simultanément les changements de calcium intracellulaire via le signal fluorescent et le potentiel membranaire à l’aide de l’électrode.

Dans cette procédure, préparez l’appareil de trituration à l’aide d’un microscope, d’une caméra et d’une platine en aluminium contenant une chambre et des micromanipulateurs. Fixez une microseringue à l’aide d’un contrôleur de pompe adjacent à la platine et à l’échantillon. Ensuite, remplissez complètement une pipette de trituration avec de l’huile minérale et fixez-la sur le piston de la microseringue.

Ensuite, à l’aide de la microseringue avec contrôleur de pompe, prélever environ 130 nanolitres de solution de dissociation dans la pipette tout en veillant à l’absence de bulles d’air. Par la suite, placez les segments artériels intacts dans un millilitre de solution de dissociation avec les concentrations requises d’enzymes dans un tube de verre de 10 millilitres.

Incuber à 34 degrés Celsius pendant 10 à 12 minutes pour une digestion partielle. Après la digestion, remplacez la solution enzymatique par 5 millilitres de solution de dissociation fraîche. À l’aide d’une pipette de 1 millilitre, transférez un segment dans la chambre contenant la solution de dissociation à température ambiante.

Ensuite, placez la pipette dans la solution de dissociation dans la chambre et positionnez-la près d’une extrémité du récipient digéré. Réglez un débit compris entre 2 et 5 nanolitres par seconde sur le contrôleur de pompe pour une trituration en douceur. Tout en regardant à travers un grossissement de 100 à 200 fois, retirez et éjectez le segment artériel pour dissocier les cellules musculaires lisses tout en produisant un tube endothélial.

Si nécessaire, utilisez soigneusement une pince à pointe fine pour séparer les adventices dissociées et la lame élastique interne du tube endothélial. Confirmez que toutes les cellules musculaires lisses sont dissociées et que seules les cellules endothéliales restent intactes dans le tube.

À l’aide de micromanipulateurs, fixez chaque extrémité du tube endothélial sur la lamelle en verre de la chambre de superfusion à l’aide de pipettes à goupillage en verre borosilicaté. Lavez les adventices dissociées et les cellules musculaires lisses de la chambre et remplacez la solution de dissociation par deux millimolaires de chlorure de calcium PSS.

Transférer la plate-forme mobile fixée au tube endothélial sur le microscope de superfusion et le banc expérimental. Ensuite, utilisez six réservoirs propres de 50 millilitres pour une administration continue de PSS et des solutions médicamenteuses respectives pendant l’expérience.

Utilisez la soupape de régulation de débit en ligne pour régler manuellement le débit aussi constant que le flux laminaire tout en adaptant l’alimentation du débit à l’aspiration sous vide. Administrer le PSS dans la chambre de superfusion du tube endothélial pendant au moins cinq minutes avant d’enregistrer les données de fond et le chargement du colorant.

Pour mesurer le potentiel membranaire en même temps que la concentration de calcium intracellulaire, tirez une électrode pointue et remplissez-la avec deux molaires de chlorure de potassium pour enregistrer à partir de cellules chargées avec le colorant Fura-2.

Pour étudier le couplage intercellulaire par transfert de colorant, remplissez la microélectrode avec de l’iodure de propidium à 0,1 % dissous dans deux molaires de chlorure de potassium. Ensuite, placez l’électrode sur un fil d’argent recouvert de chlorure dans le porte-pipette fixé à une tête d’électromètre fixée à l’aide d’un micromanipulateur.

Utilisez le micromanipulateur pour positionner brièvement la pointe de l’électrode dans le PSS qui s’écoule dans la chambre tout en regardant à travers l’objectif quatre fois. Par la suite, réglez le potentiel de la membrane au repos à zéro, ce qui correspond au potentiel du bain mis à la terre.

Si vous le souhaitez, utilisez des moniteurs de ligne de base audibles reliés à des électromètres pour associer la hauteur du son à des enregistrements potentiels. Ensuite, augmentez le grossissement à 400 fois à l’aide d’un objectif 40 fois et positionnez la pointe de l’électrode juste au-dessus d’une cellule du tube endothélial.

Ajustez la fenêtre photométrique à l’aide du logiciel de photométrie pour vous concentrer sur environ 50 à 80 cellules endothéliales. Ensuite, placez doucement l’électrode dans l’une des cellules du tube endothélial à l’aide du micromanipulateur et attendez au moins deux minutes que le potentiel de la membrane au repos se stabilise.

Une fois que le potentiel de la membrane au repos est stable à sa valeur attendue, allumez le tube photomultiplicateur à l’interface de fluorescence en l’absence de lumière et commencez l’acquisition de la concentration intracellulaire de calcium en excitant Fura-2, alternativement, à 340 et 380 nanomètres tout en collectant l’émission de fluorescence à 510 nanomètres.

Une fois que les mesures simultanées du potentiel membranaire et de la concentration intracellulaire de calcium sont établies, attendez environ cinq minutes pour la superfusion du tube endothélial avec le PSS à un débit laminaire constant avant l’application des médicaments.

Appliquez le médicament préparé dans le PSS dans la chambre de superfusion à un débit constant. Pendant le traitement médicamenteux, mesurez simultanément le potentiel membranaire dans le rapport F340/F380. Une fois l’expérience terminée, retirez l’électrode de la cellule. Ensuite, arrêtez les enregistrements respectifs du potentiel membranaire et de la concentration de calcium intracellulaire et enregistrez les fichiers pour l’analyse des données.